CRISPR) er en tredjegenerations genomredigeringsteknik: CRISPR revolutionerede verden

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) er en tredjegenerations genomredigeringsteknik, der har revolutioneret verden med sine højkapacitetsresultater. Den er blevet brugt til at behandle forskellige biologiske sygdomme og infektioner. Forskellige bakterier og andre prokaryoter (såsom arkæer) har også CRISPR/Cas9-systemer til at forsvare sig mod fager. Det er blevet rapporteret, at CRISPR/Cas9-baserede strategier kan hæmme væksten og progressionen af ​​​​triple negativ brystkræft (TNBC) ved at målrette potentielt ændrede resistensgener, transkription og epigenetisk regulering. Disse terapeutiske interventioner kan hjælpe med at løse udfordrende problemer såsom lægemiddelresistens, der observeres selv i TNBC. I øjeblikket bruges forskellige metoder til at levere CRISPR/Cas9 til målceller, såsom fysiske (mikroinjektion, elektroporation og hydrodynamiske tilstande), virale (adenoassocieret virus og lentivirus) og ikke-virale (liposomer og lipid nanopartikler). Selvom forskellige modeller er blevet udviklet til at studere de molekylære årsager til TNBC, begrænser manglen på følsomme og målrettede metoder til at levere genomredigeringsværktøjer in vivo deres kliniske anvendelse. Sammenfattende undersøger denne gennemgang omfattende fremskridtene, udfordringerne, begrænsningerne og udsigterne for CRISPR/Cas9-behandling af TNBC baseret på eksisterende evidens. Vi fremhæver også, hvordan kombinationen af ​​kunstig intelligens og maskinlæring kan forbedre CRISPR/Cas9-strategier i behandlingen af ​​TNBC.
Kræft er karakteriseret ved ukontrolleret celledeling, forstyrrelse af cellecyklus-checkpoints og mutationer i tumorsuppressorgener (TSG'er) (Matthews et al., 2022). Blandt de forskellige kræfttyper er brystkræft den mest almindelige kræfttype hos kvinder og har en høj dødelighed på verdensplan (Waks og Winer, 2019). Brystkræft er en heterogen sygdom med forskellige karakteristika, såsom histologiske og biologiske træk, klinisk præsentation og adfærd samt respons på behandling (Weigelt et al., 2010). Klassificering af brystkræft giver præcis indsigt i diagnose af brystkræft og tumorprognose. Brugen af ​​almindelige biomarkører og klinisk-patologiske træk har været det vigtigste kriterium for klassificering af brystkræft (Tsang og Tse, 2019). Prognosen og responsen på behandling af brystkræft påvirkes af adskillige faktorer, herunder tilstedeværelsen af ​​østrogenreceptor (ER), progesteronreceptor (PR), human epidermal vækstfaktorreceptor 2 (HER2/neu) samt histologisk grad, tumortype og grad. størrelse og lymfeknudemetastase (Al-Tubaiti, 2020). Fem intrinsiske molekylære undertyper af brystkræft er blevet identificeret, herunder luminal A, luminal B, HER2-beriget, basallignende og claudin-lav (Prat et al., 2015). TNBC er en molekylær undertype af kræft, der ikke udtrykker alle ER, PR og HER2 (Yin et al., 2020). Disse patologiske træk er forbundet med TNBC, hvilket bekræfter dens hurtige progression og mere aggressive natur end nogen anden type brystkræft (Feng et al., 2018). Derudover brugte Peru et al. (2000) microarray-teknologi til at omklassificere brystkræft og identificere fem intrinsiske undertyper af brystkræft (Cadenas, 2012). Basallignende brystkræft er en undertype af brystkræft, der har en triple-negativ fænotype og er forbundet med hurtig progression. Det skal bemærkes, at alle basallignende brystkræftformer ofte fejldiagnosticeres som TNBC, men kun 77% er TNBC. I modsætning hertil er 71-91% af TNBC basallignende, hvilket indikerer, at disse to typer brystkræft overlapper hinanden og repræsenterer forskellige klassifikationer (Wang D.-Y. et al., 2019). Dette skaber et behov for at karakterisere heterogeniteten af ​​TNBC for at belyse prognosen og identificere potentielle responser på nuværende og fremtidige behandlinger. Derudover tegner TNBC sig for 15-20% af alle brystkræfttilfælde og er mere almindelig hos kvinder under 50 år. BRCA1- eller BRCA2-mutationer er blevet rapporteret i cirka 20% af TNBC-tilfældene (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Studier har også vist, at TNBC har et særskilt immunmikromiljø, der omfatter høje niveauer af vaskulære endotelvækstfaktorer, tumorassocierede makrofager (TAM'er), tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL'er) og andre molekyler involveret i tumorvækst og -migration. Derfor er forståelse af mikromiljøet ved TNBC afgørende for dens prognose og behandling (Fan og He, 2022).
For at vurdere prognosen for TNBC og sikre effektiv behandling er en præcis diagnose, primært baseret på immunhistokemi (IHC) til at detektere ER, PR og HER2, og mammografi til at detektere brystneoplasmer, vigtig. Mammografi kan dog ikke tilstrækkeligt afbilde intratumorale træk såsom nekrose og fibrose (Deepak Singh et al., 2021). Da dårlig prognose og diagnose forhindrer læger i at ordinere den rigtige medicin (Chaudhary, 2020), anvendes forskellige strategier til at forbedre plejen af ​​patienter med TNBC. I øjeblikket anvendes to lægemidler, doxorubicin og cyclophosphamid, til patienter med TNBC og har vist gode resultater. Derudover anvendes andre platinholdige lægemidler, såsom carboplatin og cisplatin (Sikov et al., 2015). Derudover er PARP-hæmmere såsom Olaparib, Velaparib og PF-01367338 blevet brugt som potentielle kemoterapilægemidler til behandling af TNBC (Ishino et al., 2018). Da det er rapporteret, at Wnt/b-Catenin-, NOTCH- og Hedgehog-signalveje er involveret i forekomsten og progressionen af ​​TNBC, kan det være en vigtig strategi at målrette lægemidler mod disse signalveje (Aysola et al., 2013). Selvom kirurgi, strålebehandling og kemoterapi stadig er grundstenen i behandlingen af ​​TNBC i dag, er der gjort betydelige fremskridt i udviklingen af ​​nye behandlinger, herunder målrettet terapi, immunterapi, forskellige CRISPR-relaterede genredigeringsværktøjer såsom Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing og CRISPR/Cas9-målrettet genterapi. Her vil vi fokusere på forskellige CRISPR-relaterede genredigeringsværktøjer, der anvendes i behandlingen af ​​TNBC. Blandt dem har CRISPR/Cas9 fået udbredt opmærksomhed.
Cas9n, også kendt som Cas9 nickase, er en genetisk modificeret variant af Cas9-proteinet, der er udvundet fra CRISPR/Cas9 genomredigeringssystemet (Gupta et al., 2019). I sin oprindelige form indeholder Cas9-proteinet to nukleasedomæner: RuvC og HNH, hvis hovedfunktion er spaltning af begge DNA-strenge. I Cas9n er et af nukleasedomænerne, HNH, dog genetisk muteret og bliver inaktivt. Derfor forbliver HNH-domænet i Cas9n ikke-funktionelt. Kun RuvC-domænet forbliver aktivt, hvilket giver Cas9n mulighed for at klippe eller skabe brud på enkelte DNA-strenge (Trevino og Zhang, 2014). Sammenlignet med Cas9 kan Cas9n effektivt reducere off-target-effekter og præcist forbedre cellereparationsmekanismer. Cas9n kan bruges til at løse forskellige problemer, såsom at skabe brud på specifikke steder i dobbeltstrenget DNA. Til dette formål blev to Cas9n-molekyler kombineret og brugt sammen (Yee, 2016). Mixed lineage kinase 3 (MLK3) er en mitogen-aktiveret proteinkinase, der fungerer som en nøgleregulator under TNBC-metastase (Cronan et al., 2012).
MLK3 kan aktivere flere signalveje, der fører til TNBC-metastase. For eksempel regulerer c-Jun N-terminal kinase (JNK)-signalvejen cellemotilitet og nedbrydning af ekstracellulær matrix, og MLK3 aktiverer JNK-signalvejen, hvorved cellemotiliteten forbedres og invasive egenskaber opnås (Rattanasinchai og Gallo, 2016). MLK3 regulerer også EMT. For at gøre dette aktiverer den downstream-transkriptionsfaktorer såsom Snail, Slug og Twist. Disse faktorer hæmmer ekspressionen af ​​epitelmarkører og fremmer ekspressionen af ​​mesenkymale markører, hvilket fører til erhvervelse af en metastatisk fænotype (Casalino et al., 2023). Det er observeret, at MLK3 spiller en rolle i ECM-ombygning og aktivering af proteaser såsom matrixmetalloproteinaser (MMP'er), der nedbryder ECM. Dette letter tumorcelleinvasion og spredning til fjerne steder (Katari et al., 2019). Tidligere undersøgelser har således vist, at MLK3 spiller en kritisk rolle i TNBC. Rattanasinchai og Gallo brugte TNBC-modeller til at studere MLK3's rolle og fandt, at det fremmer kræftudvikling gennem specifikke signalveje. De brugte CRISPR/Cas9n til at redigere MLK3 og observerede en signifikant reduktion i TNBC-metastaser (Rattanasinchai og Gallo, 2016).
dCas9, ofte kaldet inaktiv Cas9, er en modificeret derivatform af Cas9-proteinet. I modsætning til aktiv Cas9 mangler dCas9 endonukleaseaktivitet, hvilket gør det ude af stand til at inducere DNA-dobbeltstrengsbrud. Derfor kan dCas9 bruges til præcist at målrette specifikke regioner i genomet uden ændringer eller modifikationer af DNA-sekvensen (Wang et al., 2016). I dCas9 inaktiveres to endonukleaseproteiner, RuvC og HNH, ved at undertrykke vigtige aminosyrerester. (Richter et al., 2016). Trods sin manglende DNA-spaltningsaktivitet spiller dCas9 en række vigtige roller i genetisk forskning og bioteknologi. For eksempel muliggør det visualisering af specifikke regioner i genomet, letter transkriptionel regulering og fremmer epigenetiske modifikationer (Brocken et al., 2018).
Transkriptionsfaktoren ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) spiller en specifik og kritisk rolle i medieringen af ​​epitel-mesenkymal overgang (EMT), en cellulær proces, der forekommer under embryonisk udvikling, vævsreparation og kræftprogression. Den involverer transformationen af ​​epitelceller til mesenkymale celler, hvilket resulterer i ændringer i cellemorfologi, motilitet, invasivitet osv. (Wu et al., 2020). ZEB1 hæmmer flere epitelmarkører, såsom E-cadherin og Occludin, som er ansvarlige for at opretholde celle-celle-adhæsion og polaritet af epitelceller i TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Derudover aktiverer ZEB1 visse markører såsom N-cadherin, vimentin og fibronektin (Konradi et al., 2014) og regulerer også gener involveret i cytoskeletremodellering, såsom Rho GTPaser og matrixmetalloproteinaser (MMP'er) (Huang). et al., 2014). 2022), derudover påvirker det også forskellige signalveje såsom transformerende vækstfaktor-β (TGF-β), Wnt-signalering osv., hvorved det fremmer tumorinvasion og metastase i TNBC (Chen et al., 2016). Talrige undersøgelser og videnskabelige beviser tyder på, at ZEB1 har et stort potentiale som et værdifuldt middel til detektion og terapeutisk intervention af TNBC. I en nylig undersøgelse anvendte Waryah et al. en TNBC-model og opnåede fuldstændig undertrykkelse af ZEB1 af dCas9. De observerede således meget høj specificitet og næsten fuldstændig hæmning af ZEB1 under in vivo-forhold (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 er et genredigeringsværktøj kaldet CRISPR/Cpf1. Det er afledt af CRISPR/Cas-systemet, hvor udtrykket Cas12 refererer til CRISPR-associeret protein 12 (Bharathkumar et al., 2022), som er fuldstændig lig Cas9. Den eneste forskel er, at det indeholder Cas12-proteinet. Sammenlignet med Cas9 har Cas12 nogle unikke funktioner, såsom at generere klæbrige ender under genredigeringsprocessen, hvorimod Cas9 genererer stumpe ender (Wang et al., 2021). Denne egenskab ved Cas12 bidrager til dets specifikke DNA-manipulationsteknologi. Som et protein, der er i stand til præcist at genkende og skære mål-DNA, har det ekstraordinær alsidighed, hvilket gør det til et effektivt værktøj til en række forskellige anvendelser, herunder genredigering (Pickar-Oliver og Gersbach, 2019).
I lighed med andre CRISPR-varianter er CRISPR/Cas12 også i stand til at slå gener ud eller aktivere dem i TNBC, hvorved gener, der spiller en vigtig rolle i dens patogenese eller respons på behandling, er målrettet mod gener, der spiller en vigtig rolle i dens patogenese eller respons på behandling (Yang og Zhang, 2023). For at opnå denne proces blev der udviklet et guide-RNA (gRNA), der dirigerer Cas12 til målgenet. Når Cas12 binder sig til sit mål, introducerer det dobbeltstrengsbrud i DNA'et og aktiverer DNA-reparationsmekanismer. Under reparationsprocessen kan forkerte nukleotider inkorporeres, hvilket fører til genmutationer og funktionstab (Zhang et al., 2021a). Derudover blev en forbedret version af Cas12-enzymet (kaldet dCas12) også brugt til at aktivere gener. Ved at kombinere det med en transkriptionsaktivator er det muligt at inducere bestemte gener og derved aktivere dem. Denne teknologi har et stort potentiale til at fremme aktiveringen af ​​tumorsuppressorgener (Sultan et al., 2022).
Prime editing er en nyudviklet og ekstremt overlegen genomredigeringsteknologi. Den er i stand til at modificere en organismes DNA meget præcist (Chen og Liu, 2023). Prime editing opnås gennem integration af to hovedkomponenter: et modificeret CRISPR/Cas9-enzym og revers transkriptase. CRISPR/Cas9-enzymets rolle er selektivt at målrette præcise steder i genomet, mens revers transkriptase hjælper med at modificere DNA'et grundigt på målstedet (Hassan et al., 2021). I primerredigeringsmekanismen involverer det første trin oprettelsen af ​​et primerredigeringsguide-RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Det indeholder målsekvensen og RNA-skabelonen, der svarer til det ønskede redigeringssted i mål-DNA'et. PegRNA'et introduceres derefter i målcellerne sammen med en primerredigeringsnuklease (PE2). PE2 er et fusionsprotein bestående af et Cas9-enzym, en revers transkriptase og en primerredigeringsadapter (Martín-Alonso et al., 2021). Inde i cellen søger pegRNA- og PE2-komplekser efter det specifikke DNA, de ønsker at modificere. Cas9-enzymet skærer DNA og skaber en skabelon bestående af enkeltstrenge (Choi et al., 2022). Reverse transkriptase bruger denne skabelon til at forberede DNA'et til redigering. Udover kopiering af DNA er der også inkluderet instruktioner til redigering af RNA-skabelonen. Endelig bruges den nyoprettede DNA-streng som skabelon til at reparere bruddet i DNA'et, hvilket resulterer i en ændret DNA-sekvens, der indeholder den ønskede modifikation (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Primerredigeringsmekanismer kan føre til udbredte mutationer i gener. Det kan målrette punktmutationer, insertioner, deletioner og endda genudskiftninger (Anzalone et al., 2019; Chen og Liu, 2023). Primeredigering tilbyder flere fordele i forhold til tidligere genomredigeringsteknologier. Disse omfatter øget nøjagtighed, reducerede off-target-effekter og muligheden for at redigere DNA uden at være afhængig af DNA-dobbeltstrengsbrud (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9-teknologien blev oprindeligt udviklet til at beskytte bakterier mod plasmidoverførsel og faginfektion og blev senere genanvendt som et effektivt RNA-baseret DNA-målretningsværktøj til genomredigering (Jiang og Doudna, 2017). Derudover er det rapporteret, at CRISPR/Cas9-systemet er til stede i henholdsvis 50 % og 87 % af bakterielle og arkæiske genomer (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 er et potentielt værktøj til deletion, indsættelse og korrektion af enhver unormal genetisk sekvens ved hjælp af in vivo- og in vitro-metoder (Sabit et al., 2021). Desuden har CRISPR/Cas9 vist sig at være en del af det adaptive immunsystem på grund af dets specificitet for målgener af interesse (Chen og Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 består af Cas9 og et enkelt guide-RNA (sgRNA). Cas9 er en endonuklease, der er sammensat af flere proteinkomponenter. Derudover har Cas9 unikke strukturelle og konformationsmæssige egenskaber (Pacesa et al., 2022), da den består af to lapper: genkendelse (REC) og nuklease (NUC). REC-lappen er yderligere opdelt i tre regioner: REC1, REC2 og brohelixer (Cromwell et al., 2018). NUC består af tre lapper, nemlig RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH og protospacer adjacent motif (PAM) interaktionsdomænet (fig. 1) (Song et al., 2016). sgRNA består af to komponenter, herunder CRISPR RNA (crRNA) og transkodende lille RNA (tracer-RNA) (figur 1). SgRNA forbinder Cas9-proteinet til connexiner for at danne et aktivt kompleks, også kendt som effektorkomplekset (Richter et al., 2012). crRNA er et basepar på 18-20 nukleotider, der spiller en afgørende rolle i genkendelsen af ​​mål-DNA-sekvenser. Derudover parrer crRNA sig med mål-DNA'et, og tracrRNA fungerer som et stillads for Cas9-nukleasen til at binde mål-DNA'et (Manghwar et al., 2019). På den anden side har PAM-sekvensen 3 nukleotider, hvilket bekræfter, specificerer og medierer bindingen af ​​effektorkomplekset til DNA. Cas9-proteinkompleks-underenhederne RuvC og HNH har katalytisk aktivitet (Richter et al., 2012; Asmamaw og Zawdie, 2021). HNH-nukleasedomænet i Cas9-underenheden spalter DNA-strengen associeret med crRNA'et. RuvC-nukleasedomænet spalter andre DNA-strenge og genererer dobbeltstrengsbrud (DSB'er), hvorefter to forskellige DNA-brudreparationsmekanismer aktiveres (Jiang og Doudna, 2017) (Figur 1).
Figur 1. Oversigt over CRISPR/Cas9 (A). Komponenter i CRISPR/Cas9-systemet: (i). Cas9-endonukleasen er ansvarlig for at klippe mål-DNA-sekvensen, (ii) et enkelt guide-RNA (sg) som følge af fusionen af ​​crRNA og tra-crRNA-kimærer. (to). Cas9 omfatter flere komponenter såsom Rec I, Rec II, NUC-lap (HNH og Ruv C er underkomponenter) og PAM-interaktionsdomæne (C) med tilsvarende funktioner. CRISPR/Cas9-proteinkomplekset spalter DNA-sekvenser i ikke-komplementære og komplementære former (D). CRISPR/Cas9 redigerer genomet i tre faser: genkendelse, skæring og reparation. Det designede sg-RNA styrer Cas9 og genkender den ønskede sekvens gennem den komplementære komponent crRNA. Cas9 genkender PAM-sekvensen ved 5′-NGG-3′ og smelter DNA'et, hvilket danner en DNA-RNA-hybrid og aktiverer spaltning. HNH-domænet i Cas9 spalter den komplementære streng, og RuvC-domænet spalter den ikke-komplementære streng. CRISPR/Cas9 reparerer dobbeltstrenget DNA ved at bryde det på to måder: ikke-homolog end joining (NHEJ) og homologirettet reparation (HDR). NHEJ reparerer dobbeltstrenget DNA i fravær af fremmed homologt DNA gennem en enzymatisk proces, en fejlbehæftet mekanisme, der kan indsætte eller fjerne tilfældige DNA-sekvenser. HDR er meget specifik og kræver homologe DNA-skabeloner.
CRISPR/Cas9-medierede reparationsveje omfatter ikke-homolog end joining (NHEJ) og homologi-rettet reparation (HDR) mekanismer. NHEJ er en fejlbehæftet vej, fordi den involverer indsættelse eller deletion og ikke kræver noget mønster under reparationsmekanismen. Den bruger tilfældige nukleotider til at generere standardproteiner (Abbasi et al., 2021). Dette reparationssystem består af fire komplekser såsom KU-komplekset, det krydskomplementerende proteinkompleks type 4 (XRCC-4), DNA-endprocessingsenzymet og proteinkinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). KU-kompleksproteinet har to underenheder, Ku 70 og Ku 80, og spiller en vigtig rolle i NHEJ-mekanismen, da reparationsmekanismen initieres ved binding af to underenheder (Ku 70 og Ku 80) til de stumpe eller næsten stumpe ender af mål-DNA'et (Abbasi et al., 2021), der fungerer som et stillads til at rekruttere andre NHEJ-relaterede faktorer til skadestedet (Yang et al., 2020). XRCC-4 og DNA-ligase er sammensat af henholdsvis 334 og 911 aminosyrer, og XRCC4-DNA-ligase IV-komplekset stimulerer ligering af DNA-ender (Chatterjee et al., 2015). DNA-endprocesseringsenzym, også kendt som polynukleotidkinase 3'-fosfat, er et DNA-endprocesseringsenzym. Det kan fjerne 3'P-gruppen i DNA og phosphorylere 5'OH-gruppen under DSB-reparation. Det involverer også reparation af enkeltstrengsbrud (SSB'er) ved hjælp af SSB-reparationsvejen (Chatterjee et al., 2015). Proteinkinase DNA-PKcs er en DNA-afhængig proteinkinase, der består af en katalytisk underenhed af PIKK'er (phosphatidylinositol 3-kinase-relaterede kinaser) og ataxia telangiectasia mutated (ATM)-familien, samt ATM- og Rad3-relaterede ATR'er, strengbrud (DSB'er) og enkeltstrengsbrud (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR er en mere præcis og passende reparationsmekanisme, fordi informationen kopieres ved hjælp af den intakte form af den homologe DNA-duplex, selvom det kræver tilstedeværelsen af ​​søsterkromatider. Dette sker i S/G2-fasen af ​​pattedyrs cellecyklus. HDR forekommer hovedsageligt i gærarter, men NHEJ er kritisk hos pattedyr (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Den komplette reparationsmekanisme er vist i figur 1.
Da TNBC er forårsaget af genetiske og epigenetiske abnormiteter, kan korrektion af maligne genomiske/epigenomiske abnormiteter ved hjælp af CRISPR/Cas9 være en rimelig terapeutisk tilgang (Chen et al., 2019). Derudover kan nogle transkriptionsfaktorer involveret i cellespecifik transkriptionel regulering udvise unikke karakteristika for kræftceller, hvilket tyder på, at transkriptionel regulering kan være en fremragende tilgang til kræftbehandling (Drost et al., 2017). Udnyttelse af disse molekylære egenskaber ved tumorer, såsom genetiske, epigenetiske og transkriptionelle defekter, til lægemiddeludvikling kan forbedre kliniske resultater og reducere screeningsomkostninger. CRISPR er et potentielt genredigeringsværktøj, der ikke kun kan detektere og identificere kræftfremkaldende genomiske mål, men også kan bruges til at redigere, undertrykke og epigenetisk modificere onkogener i humane celler (Tabel 1) (Ahmed et al., 2021). Adskillige CRISPR-screeninger er blevet udført for at lede efter gener forbundet med tumorsuppressorer, onkogener og lægemiddelresistens. Brugen af ​​CRISPR/Cas9 til at redigere forskellige TNBC-onkogener er vist i figur 2.
Figur 2. Genredigering af forskellige TNBC-onkogener ved hjælp af CRISPR/Cas9, hvilket resulterer i reduceret tumorvækst og metastase. Disse onkogener omfatter CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 og CXCR7, Crypto1, ROR1 og ST8SIA, som er involveret i forekomsten og metastasen af ​​TNBC.
Kræftcellemigration, invasion og epitelial-mesenkymal overgang (EMT) er forbundet med ITGA9. Tidligere undersøgelser har vist, at ITGA9 er en nøglespiller i Notch-signalvejen og spiller en interessant rolle i rhabdomyosarkommetastase (Molist et al., 2020). Derudover blev ITGA9 fundet tæt forbundet med patientprognose i flere tumortyper, herunder brystkræft (Wang Z. et al., 2019). Derudover viste bioinformatisk analyse af ITGA9, at dets ekspression i TNBC var signifikant højere end i andre brystkræftundertyper. Forhøjede ITGA9-niveauer er forbundet med tumormetastase og tilbagefald hos TNBC-patienter. Knockout af ITGA9 ved CRISPR/Cas9 resulterede i kræftstamcelle (CSC)-lignende egenskaber, tumorangiogenese, tumorvækst og reduceret metastase ved at fremme β-catenin-nedbrydning i TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 er et medlem af TGF-β-familien og er kritisk for tidlig embryogenese, stamcellevedligeholdelse og kræftmetastase (Ishii et al., 2021). Også kendt som Tdgf-1, er det et onkogent GPI-forankret signalprotein involveret i reguleringen af ​​dannelsen af ​​primitive streaks, mesoderm og endoderm, samt etablering af venstre/højre asymmetri i udviklingen af ​​kroppens organer under embryogenese (Zhang et al., 2021b). Derudover har Cripto-1 vist sig at være involveret i epitel-mesenkymal overgang (EMT) som en stamcellemarkør (Zhang et al., 2021b). EMT er kritisk ikke kun for forskellige processer såsom embryonal udvikling, fibrose og sårheling, men også for kræftinvasion og metastase. Derudover har Cripto-1 vist sig at interagere med fire Notch-receptorer og forbedre deres posttranslationelle modning (Brandstadter og Maillard, 2019). Notch-signalvejen er kendt for at være involveret i vedligeholdelsen af ​​humane brystkræftceller. Studier har vist, at CRISPR/Cas9-medieret knockout af Crypto-1 undertrykker kræftvækst og metastase. Derfor kan Crypto-1 blive et vigtigt terapeutisk mål for TNBC (Castro et al., 2015).
XCL12-proteinet og dets kemokinreceptor CXC (CXCR4 og CXCR7) spiller forskellige roller i kræftcelleproliferation, vækst, migration og invasion (Wu et al., 2015). Disse kemoreceptorer er blevet associeret med udviklingen af ​​TNBC gennem flere signalveje i både in vivo- og in vitro-modeller (Wu et al., 2015). Derudover er aktivering af CXCR4 og CXCR7 associeret med større modtagelighed for metastase og dårlig prognose i TNBC (Karn et al., 2022). Derfor kan knockout af CXCR4 og CXCR7 blive effektive lægemiddelmålgener til behandling af brystkræft, herunder TNBC. Undersøgelse foretaget af Yang et al. Yang et al. (2019) brugte CRISPR/Cas9 til at co-knockout CXCR4- og CXCR7-generne og fandt, at TNBC-proliferation, vækst, migration og invasion blev signifikant hæmmet (Yang et al., 2019).
Øgede niveauer af miR-3662, et TNBC-onkogen, blev observeret i brystkræftvæv (Yi et al., 2022). Nedregulering af miR-3662 har vist sig at hæmme brystkræfttumorvækst og metastase både in vivo og in vitro (Agarwal og Gupta, 2021). HBP-1 er en potent hæmmer af Wnt/-catenin-signalering og er sandsynligvis ansvarlig for miR-3662-medieret vækst af TNBC-celler. For nylig fandt Yi et al., at miR-3662-HBP1-aksen regulerer Wnt/-catenin-signalvejen i TNBC-celler (Yi et al., 2022). På grund af sin tumorspecifikke ekspression kan miR-3662 være et potentielt terapeutisk mål for TNBC. Således kan CRISPR/Cas9-medieret nedregulering af miR-3662 være en fremragende tilgang til udvikling af nye lægemidler til behandling af TNBC.
UBR5 er et 300 kDa nukleofosfoprotein, der er blevet identificeret som en nøgleregulator af tumorigenese, metastase og immunrespons i forskellige kræftformer (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 er blevet rapporteret at være stærkt opreguleret i TNBC-prøver og stimulerer ERα-funktionen ved at inducere proliferation gennem dets ubiquitinligaseaktivitet (Bolt et al., 2015). Studier af hel-exom-sekventering af primære TNBC-prøver viste også øget ekspression af UBR5, hvilket tyder på dets rolle i udviklingen af ​​TNBC. Derudover viste CRISPR/Cas9-drevet deletion af UBR5 signifikant hæmning af TNBC-metastase og -vækst i eksperimentelle musemodeller. Desuden gendannede inklusion af UBR5 i en vildtype-musemodel dets fulde funktionalitet, hvorimod denne effekt ikke blev observeret i inaktiverede mutantstammer (Liao et al., 2017). Mangel på UBR5 er forbundet med øget apoptose, nekrose og hæmning af tumorvækst i TNBC på grund af dårlig angiogenese. På grund af tabet af UBR5 reduceres tumorspredning til fjerne organer, og UBR5 inducerer unormal EMT primært ved at reducere E-cadherin-ekspression (Zhang og Weinberg, 2018). For nylig blev UBR5 vist at være en meget vigtig faktor i IFN-γ-induceret PDL1-transkription i TNBC på grund af dets manglende E3 ubiquitineringsaktivitet. RNA-transkriptomanalyse afslørede, at UBR5 kan have systemiske effekter på gener forbundet med IFN-γ-signalvejen og fremme PDL1-transaktivering ved at øge aktiveringsniveauerne af proteinkinase-RNA (PKR) og dets signaltransducere og aktivatorer, transkription 1 (STAT1) og interferon regulatorisk faktor 1 (IRF1). Imidlertid har CRISPR/Cas9-medieret kombineret ablation af UBR5- og PD-L1-ekspression en synergistisk terapeutisk effekt end begge blokader alene, med dybtgående effekter på tumormikromiljøet (Wu et al., 2022). CRISPR/Cas9 kan således være et vigtigt værktøj til at hæmme UBR5-funktionen og derved undertrykke TNBC-metastase og tumorvækst.
ROR1 er et type I transmembranprotein, der udtrykkes under kræft og embryonisk udvikling, og det er blevet identificeret som et onkoføtalt protein (Nicholas Borcherding, 2014). Den invasive adfærd hos forskellige humane kræftformer er forbundet med opregulering af ROR1. Lovende resultater er opnået fra in vivo- og in vitro-studier, der involverer terapeutiske forbindelser rettet mod ROR1 (Chien et al., 2016). Forhøjede niveauer af ROR1 mRNA i brystvævsbiopsier er også blevet forbundet med aggressive basallignende brysttumorer (BL) og deres migration til andre dele af kroppen. Desuden er overekspression af ROR1 blevet identificeret som en prognostisk markør for udviklingen af ​​TNBC (Chien et al., 2016). Imidlertid ville det være en effektiv strategi at inaktivere ROR1 ved hjælp af CRISPR/Cas9 for at undertrykke TNBC-vækst og metastase.
Sialyleringsprocessen involverer tilsætning af sialinsyre til glykokonjugater, hvilket katalyseres af sialyltransferaser (ST'er). ST8SIA1 tilhører ST-familien og spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​forskellige sygdomme såsom lymfatisk leukæmi og kolorektal cancer (Chang et al., 2018). RNA-sekvensanalyse viser, at ST8SIA1 er i høj grad udtrykt i brystvæv hos TNBC-patienter og er positivt korreleret med mutationer i tumorsuppressorgenet p53, hvilket kan bidrage til patogenesen af ​​TNBC (Battula et al., 2017). Derudover er ST8SIA1 involveret i metastase og recidiv af TNBC, hvilket tyder på, at det spiller en vigtig rolle i forekomsten og udviklingen af ​​TNBC. I en in vitro-model af TNBC blev det vist, at nedregulering af ST8SIA1 ved CRIPSR/Cas9 blokerer vækst og metastase (Battula et al., 2017). Dette tyder på, at CRISPR/Cas9 kan være et vigtigt værktøj til at hæmme funktionen af ​​ST8SIA1-onkogenet i behandlingen af ​​TNBC.
NAT1 er et metabolisk enzym, der katalyserer dannelsen af ​​fase II xenobiotiske forbindelser og udtrykkes i næsten alt humant væv. NAT1 kan bruge cofaktoren folat til at målrette acetyl-CoA (acetyl-CoA), selv i fravær af det aromatiske aminsubstrat (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Undersøgelser har vist, at NAT1 regulerer matrixmetalloproteinase 9 (MMP9)-funktionen i brystkræftcellemodeller og beskytter mod reaktive iltarter (ROS) under glukosemangel (Wang et al., 2018). Deletion af NAT1 har vist sig at hæmme pyruvatdehydrogenasekomplekset, hvilket fører til mitokondriel dysfunktion (Wang L. et al., 2019). Derudover har forskellige andre rapporter vist, at NAT1-hæmning ved hjælp af små molekyler og siRNA-silencing kan reducere invasiviteten og proliferationen af ​​brystkræftceller (Stepp et al., 2018). For nylig blev CRISPR/Cas9 brugt til at undertrykke NAT1 i brystkræftcellelinjen MDA-MB-231, hvilket påvirkede cellulær metabolisme afhængigt af dens ekspressionsniveau. Dette studie viste også, at NAT-1 er kritisk for progression og metastase af TNBC (Carlisle et al., 2020).
Koordineret transkription af onkogener reguleres af superforstærkere, transkriptionsfaktorer og cofaktorer (Hnisz et al., 2015). Derudover er en gruppe af cyclin-afhængige kinaser (CDK'er), såsom CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 og CDK13, nødvendige for transkriptionel regulering. Blandt dem er CDK7 involveret i fosforyleringen af ​​RNA polymerase II, hvilket er meget vigtigt for initiering og ekspansion af onkogentranskription i patogenesen af ​​TNBC. I et skelsættende studie hæmmede deletion af CDK7 ved CRISPR/Cas9 TNBC, hvilket indikerer, at patogenesen af ​​TNBC er CDK7-afhængig (Wang Y. et al., 2015).
Studier har vist, at mutationer i MYC og RBP (RNA-bindende protein) kan føre til apoptose, mens enkeltgenmutationer i MYC eller RBP ikke påvirker væksten af ​​kræftceller (Einstein et al., 2021). Mere end 1000 RBP'er i det menneskelige genom er blevet screenet ved hjælp af et CRISPR/Cas9-baseret bibliotek. Blandt dem blev 57 RBP'er fundet at være kritiske for væksten af ​​kræftceller med stærkt forhøjede MYC-niveauer (Wheeler et al., 2020). Derudover er YTHDF2 vigtig for at opretholde TNBC-cellevækst og reducerer mængden af ​​methylerede transkripter under transkription og translation på højt niveau i kræftceller med højere MYC-ekspression. Derudover er YTHDF2 ikke essentiel for kræftceller, som er mindre afhængige af forhøjede MYC-niveauer for at forlænge overlevelsen af ​​TNBC-patienter (Einstein et al., 2021), hvilket antyder, at det kan være et potentielt terapeutisk mål for lægemidler, der kan overvinde TNBC.
Zinkfingerproteiner (ZNF'er) udgør cirka 1% af det samlede menneskelige genom. Studier har vist, at ZNF kan regulere celleproliferation i forskellige kræftformer, såsom leverkræft, brystkræft og kolorektal cancer (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Biblioteker genereret ved CRISPR-knockout er blevet brugt til at screene forskellige tumorsuppressorgener (TSG'er) i brystkræftceller (Shalem et al., 2014). Siden da har et transkriptomisk studie af CRISPR/Cas9 ZNF319-deleterede brystkræftceller vist, at ZNF319 er et tumorsuppressorgen, der reducerer brystkræftproliferation og derfor er involveret i forskellige potentielle signalmekanismer og andre biologiske funktioner (Wang L. et al., 2022).
Ferroptose er en type programmeret celledød, der er afhængig af tilstedeværelsen af ​​jern. Det er kendt, at udviklingen af ​​ferroptose påvirkes af tilstedeværelsen af ​​lipidperoxider. Derudover er det rapporteret, at PKCβII udviser tidlig lipidperoxidation, og øget lipidperoxidation er forbundet med ferroptose. Screening af et bibliotek af CRISPR/Cas9-medierede kinasehæmmere afslørede, at PKCβII er involveret i processen med lipidperoxidation, hvilket er kritisk for ferroptose i MDA-MB-231-celler (Zhang et al., 2022). Dette tyder derfor på, at knockout af PKCβII af CRISPR/Cas9 kan være et potentielt tumorsuppressorgenmål til behandling af ferroptose-relaterede sygdomme (Zhang et al., 2022).
Lægemiddelresistens menes at være ansvarlig for cirka 90 % af dødsfaldene hos kræftpatienter og er en af ​​de største udfordringer i kræftbehandling (Bukowski et al., 2020). Resultaterne indikerer, at et tilstrækkeligt antal gener relateret til lægemiddelefflux, DNA-reparation, apoptose og forskellige cellesignalveje er forbundet med lægemiddelresistens (Haider et al., 2020). Blandt dem er adskillige gener blevet målrettet af CRISPR/Cas9-værktøjer og har vist lovende resultater med at reducere lægemiddelresistens og øge effektiviteten af ​​​​antikræftbehandlinger (Vaghari-Tabari et al., 2022). Derudover er CRISPR/Cas9-gen-knockout-screeningsbiblioteker med høj kapacitet blevet impliceret i at modificere funktionen af ​​​​potentielle lægemiddelresistensgenmål (Shalem et al., 2015). For at identificere paclitaxel-resistensgener blev RNA-sekventering koblet med genomdækkende sgRNA-biblioteksscreening brugt til at identificere otte kandidatgener, herunder histondeacetylase 9 (HDAC9), der er forbundet med lægemiddelresistens hos patienter med tilbagevendende TNBC (B et al., 2020). I et andet studie blev der observeret øget ekspression af diserin/threonin og tyrosinproteinkinase (DSTYK) under overlevelse af TNBC-patienter behandlet med kræftmedicin. Desuden forbedrede CRISPR/Cas9-medieret nedlukning af DSTYK signifikant apoptose af lægemiddelresistente kræftceller in vitro (SUM102PT-celler og MDA-MB-468-celler) og en in vivo TNBC-model (Ogbu et al., 2021).
Selvom TNBC har unormal aktivering af MAPK-signalvejen, er den kliniske effekt af MEK-målrettede terapier dårlig. En CRISPR/Cas9 genomisk biblioteksscreening viste, at hæmning af PSMG2 (proteom-assemblage chaperon 2) sensibiliserer TNBC BT549- og MB468-celler over for MEK-hæmmeren AZD6244. CRISPR/Cas9-nedlukning af PSMG2 ændrede normal proteasomfunktion, hvilket førte til autofagi-medieret nedbrydning af PDPK1, hvorved tumorceller i TNBC-musemodeller induceret af AZD6244 (MEK-hæmmer) og MG132 (proteasom-hæmmer) yderligere forbedres. Således kan proteasom- og MAP-kinase (MEK)-hæmmere administreres synergistisk for at reducere tumorcelleproliferation (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 er også blevet brugt til at screene for tab af genfunktion, der fører til TNBC-resistens (Shu et al., 2020). Ge et al. forklarede mekanismen bag lægemiddelresistens hos kræftceller behandlet med JQ1, en BET-bromodomainhæmmer (BBDI), i TNBC. Ved hjælp af CRISPR/Cas9 fandt de, at sletning af rb1-genet forårsagede, at TNBC blev resistent over for anticancerlægemidlet JQ1. Derfor er rb1-funktionen vigtig i responset på JQ1-lægemidler i TNBC. De rapporterede også, at paclitaxel er en CDK4/6-kinase/mikrotubuli-hæmmer, og dens kombination med BBDI'er såsom JQ1 kan give lovende terapeutiske responser på lægemiddelresistente TNBC (Ge et al., 2020).
Det transkriptionelle landskab af langt ikke-kodende RNA (lncRNA) er blevet rapporteret at være ansvarlig for resistens over for neoadjuverende behandling i TNBC. Denne undersøgelse viser, at fem forskellige MALAT1 lncRNA-transkripter er i høj grad udtrykt i TNBC. Derudover øgede CRISPR/Cas9-medieret deletion af MALAT1 følsomheden af ​​TNBC BT-549-celler over for paclitaxel og doxorubicin, hvilket antyder en potentiel rolle for MALAT1-resistens i TNBC (Shaath et al., 2021).
Mutationer i BRCA1 (BRCA1m) er heterogene og derfor vanskelige at opdage. Målretning af PARP1 (poly(ADP-ribose) polymerase), den syntetiske letale partner for BRCA1, kan øge TNBC-lægemiddelkemosensitiviteten. Ved hjælp af CRISPR/Cas9 øgede deletion af PARP1 følsomheden af ​​kræftlægemidler såsom doxorubicin, gemcitabin og docetaxel over for mBRCA1-mutante TNBC-celler, hvilket tyder på, at PARP1 også er involveret i lægemiddelresistens i TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutationer i tumorsuppressorgenerne BRCA1 eller BRCA2 er kendt for at øge sandsynligheden for at udvikle brystkræft hos mennesker. Behandling af disse patienter kræver brug af PARP-hæmmere. Derudover er det blevet vist, at knockout af nukleotid-salvagefaktoren DNPH1 ved hjælp af CRISPR/Cas9 kan fjerne det giftige nukleotid 5-hydroxymethyldeoxyuridin (hmdU) monofosfat og derved forbedre BRCA-defekte cellers respons på følsomhed over for PARP-hæmmere (Fugger et al., 2021). CRISPR/Cas9 og PARP1-hæmmere kan således blive en vigtig behandlingsstrategi for TNBC.
Penetrant glycoprotein (P-gp)-genet er et multiresistensgen, der generelt er opreguleret i cirka 41% af alle TNBC (Sun et al., 2020). P-gp-induceret lægemiddelefflux er blevet identificeret som en nøgleregulator af lægemiddelresistens i brystkræft. P-gp-hæmmere har vist øget følsomhed over for kræftmedicin i brystkræft (Famta et al., 2021). CRISPR/Cas9-medieret ablation eller undertrykkelse af P-gp og P-gp-hæmmere kan således være meget vigtige metoder til at overvinde lægemiddelresistens i TNBC.
ATP-bindende kassettetransportør G2 (ABCG2) er kendt for at forårsage lægemiddelresistens i TNBC (Palasuberniam et al., 2015), selvom der i øjeblikket ikke er rapporter om forholdet mellem CRISPR/Cas9 og ABCG2-silencing og inaktivering af tumorsuppressorgen. PTEN kan forstærke ABCG2-aktivering (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Derfor kan brug af CRISP/Ca9 til at fjerne ABCG2 og kombination af det med en ABCG2-hæmmer være en passende behandling til at overvinde lægemiddelresistens i TNBC. Tabel 2 nævner CRISPR/Cas9, der er rettet mod alle resistensgener.
Tabel 2. CRISPR/Cas9 målretter forskellige TNBC-resistensgener for at gøre celler sensibiliserede over for kræftmedicin.
CRISPR/Cas9-biblioteker er potentielle værktøjer til screening af genmutationer forbundet med kræftpatogenese (Chan et al., 2022). Denne screeningsmetode involverer fire trin såsom (a) bibliotekskonstruktion, (b) lentiviral transduktion, (c) fænotypisk screening og (d) målgenanalyse. Selvom TNBC har unormal aktivering af MAPK-signalvejen, er den kliniske prognose for MEK-målrettet behandling til TNBC-patienter, der bærer mutationer i tumorsuppressorgener såsom PTEN, RB1 og TP53, meget dårlig.
Derudover testede en gen-knockout-screening ved hjælp af CRISPR/Cas9 det mest potente og selektive molekyle, dehydrocatrol, som er rigeligt forekommende i guatemalanske blomster- og bladekstrakter, for at forstå effekten af ​​dehydrocatrol på MDA-MB-231. Mekanismer for selektiv cellecytotoksicitet. Mesenkymale stamcelleegenskaber hos TNBC-subtyper. Denne CRISPR/Cas9-baserede screening afslørede også, at HSD17B11, et gen, der koder for 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 11, udtrykkes i høj grad i MDA-MB-231-celler og resulterer i dehydrofalcarinol specifikt for MDA-MB-231-celler (Grant et. al., 2020). Dette antyder således, at CRISPR/Cas9 genomisk screening har et stort potentiale til at identificere de mekanismer, der ligger til grund for de anticanceregenskaber af potentielle naturlige forbindelser.
Derudover blev TNBC's sårbarhed over for kræft undersøgt ved hjælp af en objektiv genomdækkende in vivo CRISPR/Cas9-screening, som viste en sammenhæng mellem onkogene og tumorsuppressorveje. Nøglekomponenter i mTOR- og Hippo-vejene er rapporteret at spille vigtige roller i tumorregulering i TNBC. Derudover har undersøgelser vist, at farmakologisk hæmning af mTORC1/2 og YAP-onkoprotein effektivt hæmmer patogeniciteten af ​​TNBC ved hjælp af en in vitro-lægemiddelmatrixsynergimodel og in vivo patient-afledte xenografter. Desuden forstærker Torin-1-medieret mTORC1/2-hæmning makropinocytose, hvorimod verteporfin-induceret YAP-hæmning fører til TNBC-celledød. Samlet set fremhæver disse resultater styrken og robustheden af ​​genomdækkende in vivo CRISPR-screening til at identificere nye og effektive behandlinger for TNBC (Dai et al., 2021).
Dysregulering af immunsystemet er en vigtig faktor i tumordannelse. Kræftceller undgår immunforsvarets clearance ved at omgå forsvarsmekanismer, herunder ved at forstyrre immuncellernes aktivitet i tumormikromiljøet og kompromittere immunsystemet. Derfor kan udvikling af et forbedret immunsystem være en nøgletilgang til at bekæmpe tumorer. Brugen af ​​CRISPR/Cas9-baseret genmodifikation adresserer adskillige problemer relateret til immundysfunktion fra forskellige perspektiver. CRISPR/Cas9 er blevet brugt til at forbedre antitumorimmunitet mod brystkræft gennem følgende veje (Figur 3).
Figur 3. CRISPR/Cas9-immunterapi er rettet mod TNBC-celler. Tab af CDK5 og nedlukning af PDL1 og CD155 styrker immunsystemet. Ligeledes øgede tab af A2AR og nedlukning af TAA'er såsom HER2, mucin 1 og TEM8 effektiviteten af ​​CAR-T-celler i at dræbe kræftceller. CRISPR/Cas9-drevet T-cellescreening har vist, at forstyrrelse af p38-kinase forstærker T-celle-antitumoraktivitet. T-celler modificeret af CRISPR/Cas9 øger ekspressionen af ​​TCR (T-cellereceptor), hvilket resulterer i, at T-celler har antitumoraktivitet.
Målet med immunterapi er at stimulere immunsystemet til at angribe kræftceller. Overekspression af immune checkpointproteiner forhindrer normalt autoimmune reaktioner, men kan hjælpe kræft med at undgå dem (Topalian et al., 2015). Disse proteiner forhindrer immunreaktioner ved at binde sig til receptorer på overfladen af ​​immunceller. Flere checkpointproteiner (såsom CD155 og PD-L1) er rettet mod PD-1-receptoren på immunceller og udtrykkes i brystkræft, især TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Nedregulering af PD-L1 eller dets receptor ved hjælp af CRISPR/Cas9 kan stimulere immunsystemet til at angribe TNBC-tumorer (Yahata et al., 2019). Derudover har nedregulering af PD-L1-ekspression gennem CRISPR/Cas9-medieret deletion af CDK5 vist sig at hæmme tumorvækst in vitro og in vivo (Deng et al., 2020). Væksthæmning i in vitro- og in vivo-modeller af brystkræft antyder, at shRNA-medieret reduktion af CD155 kan have en terapeutisk effekt på brystkræft (Gao et al., 2018).
CAR T-celler udtrykker CAR'er, der genkender tumorassocierede antigener (TAA'er) og kan bruge knockdown af checkpointproteiner til at forbedre deres aktivitet (Li C. et al., 2020). Der er forskellige potentielle mål for CAR T-celleterapi mod brystkræft, herunder adskillige TAA'er såsom HER2, mucin1 og TEM8 (Bajgain et al., 2018). Der er bevis for, at CAR T-celler, der er målrettet mod mesothelin (overudtrykt i TNBC BT-459-celler), er mere effektive mod kræft, når PD-1 slås ud ved hjælp af CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Isolering af T-celler fra patienter og derefter redigering af dem ex vivo er dog en arbejdskrævende og tidskrævende proces. Selvom universelle T-celler kan reducere isolationskravene, bør donor-T-celler, der udtrykker human leukocytantigen (HLA) klasse I og T-cellereceptor (TCR), fjernes for at forhindre graft-versus-host-abnormiteter (Ren et al., 2017, 2017a). Ved hjælp af CRISPR/Cas9 kan HDR samtidigt eliminere TCR og HLA og slå genet, der koder for CAR, ud. Studier har vist, at CRISPR/Cas9 kan bruges til at introducere anti-CD19 CAR'er i TCR-locuset og derved effektivt producere CAR'er uden at udtømme T-celler (Dimitri et al., 2022). Multiplex-teknologier er blevet udviklet til at generere allogene CAR T-celler ved samtidig at eliminere TCR, beta-2-mikroglobulin (B2M), HLA-I-subunit og andre proteiner såsom PD-1 og CTLA-4, som kan have bedre anticanceregenskaber mod TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Brug af CRISPR/Cas9 kan forbedre effektiviteten af ​​CAR-T-celler. Adenosin er kendt for at have immunsuppressive egenskaber og kan reducere anticancerimmunitet ved at blokere T-cellefunktionen og aktivere adenosin A2A-receptorer (A2AR) (Vigano et al., 2019). Silencing af A2AR ved hjælp af CRISPR/Cas9 forbedrede CAR-T-cellers effektivitet in vivo signifikant (Giuffrida et al., 2021). T-celler er kendt for at udvise forskellige fænotypiske egenskaber såsom cellulær ekspansion, differentiering, oxidativ stress og genomisk stress. CRISPR/Cas9-baseret T-cellescreening afslørede forstyrrelse af 25 forskellige T-cellereceptorkinaser. Blandt dem har deletion af p38-kinase vist sig at forbedre T-cellers antitumoraktivitet, hvilket indikerer, at p38-kinase er en nøgleregulator af CAR-T-celleregulering (Gurusamy et al., 2020).
T-celler kan genetisk modificeres ved hjælp af CRISPR/Cas9 for at producere højt udtrykte TCR'er. Overførsel af genetisk modificerede T-celler til patienter har vist stærkere anticanceraktivitet end endogene T-celler. Derfor kan endogene TCR'er konkurrere med genetisk ændrede TCR'er hos patienter, hvilket kan påvirke potentialet for kræftimmunterapi. For at overvinde dette problem kan brugen af ​​CRISPR/Cas9 til at fjerne endogen TCR-β i recipientceller og efterfølgende overføre TCR-β T-celler til kræftpatienter udvise bedre anticancerimmunresponser uden behov for endogen seksuel TCR-konkurrence (Fan et al. 2018). Med undtagelse af CRISPR-modificerede T-celler er TCR'er således tusind gange mere følsomme over for tumorantigener end normale TCR-transducerede T-celler. Derudover udviser ændrede T-celler genereret af γδ TCR+ CRISPR i forskellige leukæmier højere ekspression af CD4+ og CD8+ T-celler end standard TCR-overførsel (Legut et al., 2018). Modificerede T-celler genereret af CRISPR/Cas9 kan således være en effektiv immunterapimetode til at overvinde TNBC.
Integriner er celleadhæsionsmolekyler, der findes i cellulære transmembraner og fremmer cellers binding til den ekstracellulære matrix (ECM) (Hamidi og Ivaska, 2018). Dysregulering af integriner er forbundet med kræftudvikling og -migration ved at ændre den ekstracellulære matrix, hvilket fører til kræftcelleoverlevelse i kredsløbet (Hamidi og Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-medieret integrin-knockdown bremser tumorprogression, metastase og kolonisering i TNBC. Knockdown af integrin a5 (ITGA5) er blevet rapporteret at reducere cellemigration og -progression i andre kræftformer såsom lungekræft (Ju et al., 2017), hvilket antyder, at integrin a5 også kan være en nøglefaktor i patogenesen af ​​TNBC.
Generering af knockout-mus ved hjælp af traditionelle embryonale stamcellemetoder (ES) er en arbejdsintensiv, tidskrævende og ineffektiv proces. Det tager måneder og år at målrette ES-celler gennem homolog rekombination, avle kimære mus og derefter krydse dem med heterozygote mus for at producere homozygote afkom. Kompleks krydsning er nødvendig for at skabe mus med flere genetiske mutationer. Der er dog opstået mange problemer, når man bruger mus genereret ved ablation af ES-celler ved hjælp af CRISPR/Cas9 eller ved mikroinjicering af CRISPR/Cas9-komponenter i enkeltcellede befrugtede æg. For eksempel forekommer introduktion af ændringer ofte ved bialleliske loci og er ikke genspecifik. Det blev for nylig rapporteret, at ES-celler ved hjælp af CRISPR/Cas9-teknologi samtidigt kan indsætte bialleliske mutationer i op til 5 gener (Nishizono et al., 2021). Til dette formål blev Cas9 mRNA og fem genspecifikke gRNA'er transficeret samtidigt ind i ES-celler. Dette understreger det lovende og effektive ved denne procedure, selvom disse mutationer muligvis er blevet videreført, da grundlæggerlinjer blev avlet for at producere femdobbelte knockout-mus. Undersøgelsen rapporterer også en overraskende opdagelse: ES-celler er ikke længere nødvendige for at skabe genetisk modificerede mus. I stedet blev Cas9 mRNA og gRNA injiceret i enkeltcellede embryoner for at fjerne specifikke genprodukter. Som et resultat er der blevet skabt knockout-grundlæggerlinjer, som teoretisk set kan bruges til at studere konsekvenserne af gendeletion hos mus (Qin et al., 2016). CRISPR/Cas9 muliggør således skabelsen af ​​transgene mus til behandling af TNBC til en lavere pris end traditionel genteknologi. Ved hjælp af CRISPR/Cas-systemet er der udviklet en ny knockout-musemodel, der med succes kan introducere punktmutationer i et eller flere endogene gener i TNBC. Baseret på dette koncept kan dyremodeller af TNBC også udvikles ved hjælp af CRISPR/Cas9-medieret deletion af BRCA1 og p53, hvilket resulterer i tab af HR-reparation, genomisk ustabilitet og mutante fænotyper (Annunziato et al., 2020).
I øjeblikket anvendes forskellige metoder såsom mammografi, magnetisk resonansbilleddannelse (MR) og ultralyd til at diagnosticere TNBC. Disse metoder har dog nogle begrænsninger. Mammografi bruges til at diagnosticere lokalt brystvæv snarere end metastaser, hvor kræftceller har migreret til andre organer. Ultralyd er ikke en pålidelig metode til at diagnosticere TNBC (Chen og Lee-Felker, 2023). MR har højere følsomhed end ultralyd og mammografi, men dens diagnostiske nøjagtighed er begrænset (Sha og Chen, 2022). Vævsbiopsi er en invasiv måde at identificere kræftceller på. I nogle tilfælde kan en biopsi dog overse kræftvæv, hvis nålen bevæger sig væk fra det pågældende område. Derudover er det meget dyrt og kan være traumatisk for patienten. TNBC er en heterogen type kræft, så en biopsi giver muligvis ikke tilstrækkelig information om kræfttypen. Derfor er der et presserende behov for en ny diagnostisk pålidelig metode til at detektere TNBC. CRISPR/Cas9 kan tjene som et meget følsomt og minimalt invasivt alternativ til diagnose af brystkræft. Med dette formål kan CRISPR/Cas9-baserede strategier bruges til at forbedre PCR-metoder til diagnosticering af TNBC. Først bruges Cas9- og cpf1-proteinerne fra CRISPR-systemet til at fjerne uspecifikt DNA, og derefter kan disse to proteiner (Cas9 og cpf1) genkende PAM-sekvensen, før de binder til mål-DNA'et (Deepak Singh et al., 2021). PCR kan således identificere mutationer forbundet med kræftudvikling. Flere undersøgelser har anvendt denne CRISPR-baserede strategi til at detektere forskellige mutationer i forskellige kræftformer (Safari et al., 2019). CRISPR-baserede PCR-metoder kan således reducere afhængigheden af ​​TNBC-diagnose af invasive metoder såsom biopsibaseret immunhistokemi.
Genotypiske ændringer i hormonreceptorregulering er også blevet påvist i TNBC (Chen og Russo, 2009). CRISPR/Cas9-baserede PCR-strategier, der bruger mikroarrays til diagnostik på stedet, kan effektivt overvåge disse mutationer (Hajian et al., 2019). Det kan også give sundhedspersonale relevante oplysninger om specifikke mutationer hos TNBC-patienter, hvilket kan bidrage til at forbedre deres behandlingsforløb. Denne kombinerede teknik har dog begrænsninger. Derfor kræves der omfattende forskningsindsatser, før denne CRISPR/Cas-PCR-metode kan anvendes i sundhedsvæsenet til diagnosticering af TNBC (Yang et al., 2019).