Differentialdiagnose af lungeknuder identificeret ved computertomografi (CT) er fortsat en udfordring i klinisk praksis. Her karakteriserer vi det globale metabolom af 480 serumprøver, inklusive raske kontrolpersoner, godartede lungeknuder og lungeadenocarcinom i stadium I. Adenocarcinomer udviser unikke metabolomiske profiler, hvorimod godartede knuder og raske individer har høj lighed i metabolomiske profiler. I opdagelsesgruppen (n = 306) blev et sæt af 27 metabolitter identificeret for at differentiere mellem godartede og maligne knuder. AUC for diskriminantmodellen i den interne validerings- (n = 104) og eksterne validerings- (n = 111) grupperne var henholdsvis 0,915 og 0,945. Signalvejsanalyse afslørede øgede glykolytiske metabolitter forbundet med nedsat tryptofan i lungeadenocarcinomserum sammenlignet med godartede knuder og raske kontrolpersoner og antydede, at tryptofanoptagelse fremmer glykolyse i lungekræftceller. Vores undersøgelse fremhæver værdien af serummetabolitbiomarkører i vurderingen af risikoen for lungeknuder påvist ved CT.
Tidlig diagnose er afgørende for at forbedre overlevelsesraten for kræftpatienter. Resultater fra det amerikanske nationale lungekræftscreeningsforsøg (NLST) og det europæiske NELSON-studie har vist, at screening med lavdosis computertomografi (LDCT) kan reducere dødeligheden af lungekræft betydeligt i højrisikogrupper1,2,3. Siden den udbredte brug af LDCT til screening for lungekræft er forekomsten af tilfældige radiografiske fund af asymptomatiske lungeknuder fortsat med at stige4. Lungeknuder defineres som fokale uklarheder på op til 3 cm i diameter5. Vi har vanskeligheder med at vurdere sandsynligheden for malignitet og håndtere det store antal lungeknuder, der opdages tilfældigt på LDCT. Begrænsninger ved CT kan føre til hyppige opfølgende undersøgelser og falsk positive resultater, hvilket fører til unødvendig intervention og overbehandling6. Derfor er der behov for at udvikle pålidelige og nyttige biomarkører til korrekt at identificere lungekræft i de tidlige stadier og differentiere de fleste godartede knuder ved initial detektion7.
Omfattende molekylær analyse af blod (serum, plasma, perifere mononukleære blodceller), herunder genomik, proteomik eller DNA-methylering8,9,10, har ført til en stigende interesse for opdagelsen af diagnostiske biomarkører for lungekræft. I mellemtiden måler metabolomiske tilgange cellulære slutprodukter, der er påvirket af endogene og eksogene virkninger, og anvendes derfor til at forudsige sygdomsdebut og -udfald. Væskekromatografi-tandemmassespektrometri (LC-MS) er en udbredt metode til metabolomiske studier på grund af dens høje følsomhed og store dynamiske område, som kan dække metabolitter med forskellige fysisk-kemiske egenskaber11,12,13. Selvom global metabolomisk analyse af plasma/serum er blevet brugt til at identificere biomarkører forbundet med lungekræftdiagnose14,15,16,17 og behandlingseffektivitet,18 er serummetabolitklassifikatorer til at skelne mellem godartede og maligne lungeknuder stadig meget undersøgt. - massiv forskning.
Adenocarcinom og pladecellecarcinom er de to primære undertyper af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Forskellige CT-screeningstests indikerer, at adenocarcinom er den mest almindelige histologiske type lungekræft1,19,20,21. I dette studie anvendte vi ultraperformance liquid chromatography-high-resolution massespektrometri (UPLC-HRMS) til at udføre metabolomisk analyse på i alt 695 serumprøver, inklusive raske kontrolpersoner, godartede lungeknuder og CT-detekteret ≤3 cm. Screening for stadium I lungeadenocarcinom. Vi identificerede et panel af serummetabolitter, der adskiller lungeadenocarcinom fra godartede knuder og raske kontrolpersoner. Analyse af berigelsespathways viste, at unormal tryptofan- og glukosemetabolisme er almindelige ændringer i lungeadenocarcinom sammenlignet med godartede knuder og raske kontrolpersoner. Endelig etablerede og validerede vi en serummetabolisk klassifikator med høj specificitet og sensitivitet til at skelne mellem maligne og benigne lungeknuder påvist ved LDCT, hvilket kan hjælpe med tidlig differentialdiagnose og risikovurdering.
I det aktuelle studie blev der retrospektivt indsamlet serumprøver efter køn og alder fra 174 raske kontrolpersoner, 292 patienter med godartede lungeknuder og 229 patienter med lungeadenokarcinom i stadium I. Demografiske karakteristika for de 695 forsøgspersoner er vist i den supplerende tabel 1.
Som vist i figur 1a blev i alt 480 serumprøver, herunder 174 raske kontrolprøver (HC), 170 benigne knuder (BN) og 136 stadium I lungeadenocarcinom (LA)-prøver, indsamlet på Sun Yat-sen University Cancer Center. En discovery-kohorte for umålrettet metabolomisk profilering ved hjælp af ultraperformance liquid chromatography-high-resolution massespectrometri (UPLC-HRMS). Som vist i supplerende figur 1 blev differentielle metabolitter mellem LA og HC, LA og BN identificeret for at etablere en klassifikationsmodel og yderligere udforske differentiel pathway-analyse. 104 prøver indsamlet af Sun Yat-sen University Cancer Center og 111 prøver indsamlet af to andre hospitaler blev underkastet henholdsvis intern og ekstern validering.
a Studiepopulation i opdagelseskohorten, der gennemgik global serummetabolomikanalyse ved hjælp af ultralydsvæskekromatografi-højopløsningsmassespektrometri (UPLC-HRMS). b Partiel mindste kvadraters diskriminantanalyse (PLS-DA) af det samlede metabolom fra 480 serumprøver fra studiekohorten, inklusive raske kontrolpersoner (HC, n = 174), benigne knuder (BN, n = 170) og stadium I lungeadenocarcinom (Los Angeles, n = 136). +ESI, positiv elektrospray-ioniseringstilstand, -ESI, negativ elektrospray-ioniseringstilstand. c-e Metabolitter med signifikant forskellige forekomster i to givne grupper (tosidet Wilcoxon signed rank test, falsk opdagelsesratejusteret p-værdi, FDR <0,05) er vist med rødt (foldændring > 1,2) og blåt (foldændring < 0,83). ) vist på vulkangrafikken. f Hierarkisk klyngevarmekort, der viser signifikante forskelle i antallet af annoterede metabolitter mellem LA og BN. Kildedata leveres i form af kildedatafiler.
Det samlede serummetabolom af 174 HC, 170 BN og 136 LA i opdagelsesgruppen blev analyseret ved hjælp af UPLC-HRMS-analyse. Vi viser først, at kvalitetskontrolprøver (QC) klynger sig tæt sammen i midten af en uovervåget principal component analysis (PCA)-model, hvilket bekræfter stabiliteten af den aktuelle undersøgelses ydeevne (Supplerende Figur 2).
Som vist i den partielle mindste kvadraters diskriminantanalyse (PLS-DA) i figur 1b, fandt vi, at der var klare forskelle mellem LA og BN, LA og HC i positive (+ESI) og negative (-ESI) elektrosprayioniseringstilstande isoleret. Der blev dog ikke fundet signifikante forskelle mellem BN og HC under +ESI- og -ESI-forhold.
Vi fandt 382 differentielle træk mellem LA og HC, 231 differentielle træk mellem LA og BN og 95 differentielle træk mellem BN og HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0,05 og multiple change >1,2 eller <0,83) (Figur 1c-e). Toppe blev yderligere annoteret (Supplerende Data 3) mod en database (mzCloud/HMDB/Chemspider-bibliotek) ved hjælp af m/z-værdi, retentionstid og fragmenteringsmassespektrumsøgning (detaljer beskrevet i Metodeafsnittet) 22. Endelig blev 33 og 38 annoterede metabolitter med signifikante forskelle i forekomst identificeret for henholdsvis LA versus BN (Figur 1f og Supplerende Tabel 2) og LA versus HC (Supplerende Figur 3 og Supplerende Tabel 2). I modsætning hertil blev kun 3 metabolitter med signifikante forskelle i forekomst identificeret i BN og HC (Supplerende Tabel 2), hvilket stemmer overens med overlapningen mellem BN og HC i PLS-DA. Disse differentielle metabolitter dækker en bred vifte af biokemiske stoffer (Supplerende Figur 4). Samlet set viser disse resultater signifikante ændringer i serummetabolomet, der afspejler malign transformation af lungekræft i tidligt stadie sammenlignet med godartede lungeknuder hos raske forsøgspersoner. Samtidig antyder ligheden mellem serummetabolomet af BN og HC, at godartede lungeknuder kan dele mange biologiske karakteristika med raske individer. I betragtning af at epidermal growth factor receptor (EGFR) genmutationer er almindelige i lungeadenocarcinom subtype 23, søgte vi at bestemme virkningen af drivermutationer på serummetabolomet. Vi analyserede derefter den samlede metaboliske profil for 72 tilfælde med EGFR-status i lungeadenocarcinomgruppen. Interessant nok fandt vi sammenlignelige profiler mellem EGFR-mutantpatienter (n = 41) og EGFR vildtypepatienter (n = 31) i PCA-analyse (Supplerende Figur 5a). Vi identificerede imidlertid 7 metabolitter, hvis forekomst var signifikant ændret hos patienter med EGFR-mutation sammenlignet med patienter med vildtype EGFR (t-test, p < 0,05 og fold change > 1,2 eller < 0,83) (Supplerende figur 5b). Størstedelen af disse metabolitter (5 ud af 7) er acylcarnitiner, som spiller en vigtig rolle i fedtsyreoxidationsveje.
Som illustreret i arbejdsgangen vist i figur 2a, blev biomarkører til knudeklassificering opnået ved hjælp af mindste absolutte krympningsoperatorer og selektion baseret på 33 differentielle metabolitter identificeret i LA (n = 136) og BN (n = 170). Bedste kombination af variabler (LASSO) – binær logistisk regressionsmodel. Tifold krydsvalidering blev brugt til at teste modellens pålidelighed. Variabelvalg og parameterregularisering justeres ved en sandsynlighedsmaksimeringsstraf med parameter λ24. Global metabolomisk analyse blev yderligere udført uafhængigt i den interne validerings- (n = 104) og eksterne validerings- (n = 111) gruppe for at teste klassificeringspræstationen af diskriminantmodellen. Som et resultat blev 27 metabolitter i opdagelsessættet identificeret som den bedste diskriminantmodel med den største gennemsnitlige AUC-værdi (fig. 2b), hvoraf 9 havde øget aktivitet og 18 nedsat aktivitet i LA sammenlignet med BN (fig. 2c).
Arbejdsgang til opbygning af en pulmonal knudeklassifikator, herunder udvælgelse af det bedste panel af serummetabolitter i opdagelsessættet ved hjælp af en binær logistisk regressionsmodel via tifold krydsvalidering og evaluering af prædiktiv ydeevne i interne og eksterne valideringssæt. b Krydsvalideringsstatistik for LASSO-regressionsmodellen til udvælgelse af metaboliske biomarkører. Ovenstående tal repræsenterer det gennemsnitlige antal biomarkører valgt ved en given λ. Den røde stiplede linje repræsenterer den gennemsnitlige AUC-værdi ved den tilsvarende lambda. Grå fejlsøjler repræsenterer minimums- og maksimums-AUC-værdierne. Den stiplede linje angiver den bedste model med de 27 udvalgte biomarkører. AUC, arealet under ROC-kurven (receiver operating characteristic). c Fold-ændringer af 27 udvalgte metabolitter i LA-gruppen sammenlignet med BN-gruppen i opdagelsesgruppen. Rød kolonne – aktivering. Den blå kolonne er et fald. d–f ROC-kurver (receiver operating characteristic), der viser diskriminantmodellens styrke baseret på 27 metabolitkombinationer i opdagelses-, interne og eksterne valideringssæt. Kildedata leveres i form af kildedatafiler.
En prædiktionsmodel blev oprettet baseret på de vægtede regressionskoefficienter for disse 27 metabolitter (Supplerende Tabel 3). ROC-analyse baseret på disse 27 metabolitter gav en areal under kurven (AUC) værdi på 0,933, en opdagelsesgruppefølsomhed på 0,868, og en specificitet på 0,859 (Fig. 2d). Blandt de 38 annoterede differentielle metabolitter mellem LA og HC opnåede et sæt af 16 metabolitter en AUC på 0,902 med en følsomhed på 0,801 og en specificitet på 0,856 i at skelne mellem LA og HC (Supplerende Figur 6a-c). AUC-værdier baseret på forskellige foldændringstærskler for differentielle metabolitter blev også sammenlignet. Vi fandt, at klassifikationsmodellen klarede sig bedst i at skelne mellem LA og BN (HC), når foldændringsniveauet var sat til 1,2 versus 1,5 eller 2,0 (Supplerende Figur 7a,b). Klassifikationsmodellen, baseret på 27 metabolitgrupper, blev yderligere valideret i interne og eksterne kohorter. AUC var 0,915 (sensitivitet 0,867, specificitet 0,811) for intern validering og 0,945 (sensitivitet 0,810, specificitet 0,979) for ekstern validering (fig. 2e, f). For at vurdere interlaboratorieeffektiviteten blev 40 prøver fra den eksterne kohorte analyseret i et eksternt laboratorium som beskrevet i metodeafsnittet. Klassifikationsnøjagtigheden opnåede en AUC på 0,925 (supplerende figur 8). Da lungepladecellecarcinom (LUSC) er den næstmest almindelige undertype af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) efter lungeadenokarcinom (LUAD), testede vi også den validerede potentielle anvendelighed af metaboliske profiler. BN og 16 tilfælde af LUSC. AUC for at skelne mellem LUSC og BN var 0,776 (supplerende figur 9), hvilket indikerer en dårligere evne sammenlignet med at skelne mellem LUAD og BN.
Studier har vist, at størrelsen af knuder på CT-billeder er positivt korreleret med sandsynligheden for malignitet og fortsat er en væsentlig faktor for knudebehandling25,26,27. Analyse af data fra den store kohorte af NELSON-screeningsundersøgelsen viste, at risikoen for malignitet hos forsøgspersoner med knuder <5 mm var endda den samme som hos forsøgspersoner uden knuder28. Derfor er minimumsstørrelsen, der kræver regelmæssig CT-overvågning, 5 mm, som anbefalet af British Thoracic Society (BTS), og 6 mm, som anbefalet af Fleischner Society29. Knuder større end 6 mm og uden åbenlyse godartede træk, kaldet ubestemte pulmonale knuder (IPN), er dog fortsat en stor udfordring i evaluering og behandling i klinisk praksis30,31. Vi undersøgte derefter, om knudestørrelsen påvirkede metabolomiske signaturer ved hjælp af samlede prøver fra opdagelses- og intern valideringskohorterne. Med fokus på 27 validerede biomarkører sammenlignede vi først PCA-profilerne af HC- og BN-metabolomer sub-6 mm. Vi fandt, at de fleste datapunkter for HC og BN overlappede hinanden, hvilket viser, at serummetabolitniveauerne var ens i begge grupper (fig. 3a). Funktionskortene på tværs af forskellige størrelsesintervaller forblev bevarede i BN og LA (fig. 3b, c), hvorimod der blev observeret en adskillelse mellem maligne og benigne knuder i området 6-20 mm (fig. 3d). Denne kohorte havde en AUC på 0,927, en specificitet på 0,868 og en sensitivitet på 0,820 for at forudsige maligniteten af knuder, der målte 6 til 20 mm (fig. 3e, f). Vores resultater viser, at klassifikatoren kan fange metaboliske ændringer forårsaget af tidlig malign transformation, uanset knudens størrelse.
ad Sammenligning af PCA-profiler mellem specificerede grupper baseret på en metabolisk klassifikator af 27 metabolitter. CC og BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs. BN 6-20 mm. i LA 6-20 mm versus LA 20-30 mm. g BN 6-20 mm og LA 6-20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6-20 mm, n = 91; LA 6-20 mm, n = 89; LA 20-30 mm, n = 77. e Receiver Operating Characteristic (ROC)-kurve, der viser diskriminantmodellens ydeevne for knuder på 6-20 mm. f Sandsynlighedsværdier blev beregnet baseret på den logistiske regressionsmodel for knuder, der måler 6-20 mm. Den grå stiplede linje repræsenterer den optimale cutoff-værdi (0,455). Ovenstående tal repræsenterer den procentdel af tilfælde, der forventes for Los Angeles. Brug en tosidet Student's t-test. PCA, principal component analysis. AUC-arealet under kurven. Kildedata leveres i form af kildedatafiler.
Fire prøver (i alderen 44-61 år) med lignende pulmonale knudestørrelser (7-9 mm) blev yderligere udvalgt for at illustrere ydeevnen af den foreslåede malignitetsforudsigelsesmodel (fig. 4a, b). Ved indledende screening præsenterede tilfælde 1 sig som en solid knude med forkalkning, et træk forbundet med benignitet, hvorimod tilfælde 2 præsenterede sig som en ubestemt delvist solid knude uden åbenlyse benigne træk. Tre runder af opfølgende CT-scanninger viste, at disse tilfælde forblev stabile over en 4-årig periode og derfor blev betragtet som benigne knuder (fig. 4a). Sammenlignet med klinisk evaluering af serielle CT-scanninger identificerede single-shot serummetabolitanalyse med den nuværende klassificeringsmodel hurtigt og korrekt disse benigne knuder baseret på probabilistiske begrænsninger (tabel 1). Figur 4b i tilfælde 3 viser en knude med tegn på pleural retraktion, som oftest er forbundet med malignitet32. Tilfælde 4 præsenterede sig som en ubestemt delvist solid knude uden tegn på en benign årsag. Alle disse tilfælde blev forudsagt som maligne ifølge klassifikatormodellen (Tabel 1). Vurderingen af lungeadenokarcinom blev demonstreret ved histopatologisk undersøgelse efter lungeresektionskirurgi (fig. 4b). For det eksterne valideringssæt forudsagde den metaboliske klassifikator nøjagtigt to tilfælde af ubestemte lungeknuder større end 6 mm (supplerende figur 10).
CT-billeder af det aksiale vindue i lungerne i to tilfælde af godartede knuder. I tilfælde 1 viste CT-scanning efter 4 år en stabil, solid knude på 7 mm med forkalkning i højre underlap. I tilfælde 2 afslørede CT-scanning efter 5 år en stabil, delvist solid knude med en diameter på 7 mm i højre overlap. b CT-billeder af lungerne med aksialt vindue og tilsvarende patologiske undersøgelser af to tilfælde af adenocarcinom i stadium I før lungeresektion. Tilfælde 3 afslørede en knude med en diameter på 8 mm i højre overlap med pleural retraktion. Tilfælde 4 afslørede en delvist solid glassknude på 9 mm i venstre overlap. Hæmatoxylin- og eosin (H&E)-farvning af resekeret lungevæv (skalabar = 50 μm) demonstrerer det acinære vækstmønster for lungeadenocarcinom. Pile angiver knuder detekteret på CT-billeder. H&E-billeder er repræsentative billeder af flere (>3) mikroskopiske felter undersøgt af patologen.
Samlet set viser vores resultater den potentielle værdi af serummetabolitbiomarkører i differentialdiagnosen af lungeknuder, hvilket kan udgøre udfordringer ved evaluering af CT-screening.
Baseret på et valideret differentielt metabolitpanel, søgte vi at identificere biologiske korrelater af større metaboliske ændringer. KEGG-signalvejsberigelsesanalyse foretaget af MetaboAnalyst identificerede 6 fælles signifikant ændrede signalveje mellem de to givne grupper (LA vs. HC og LA vs. BN, justeret p ≤ 0,001, effekt > 0,01). Disse ændringer var karakteriseret ved forstyrrelser i pyruvatmetabolisme, tryptofanmetabolisme, niacin- og nikotinamidmetabolisme, glykolyse, TCA-cyklussen og purinmetabolisme (fig. 5a). Vi udførte derefter yderligere målrettede metabolomics for at verificere større ændringer ved hjælp af absolut kvantificering. Bestemmelse af fælles metabolitter i almindeligt ændrede signalveje ved hjælp af triple quadrupole massespektrometri (QQQ) ved hjælp af autentiske metabolitstandarder. Demografiske karakteristika for målprøven fra metabolomikstudiet er inkluderet i supplerende tabel 4. I overensstemmelse med vores globale metabolomikresultater bekræftede kvantitativ analyse, at hypoxanthin og xanthin, pyruvat og laktat var forhøjet i LA sammenlignet med BN og HC (fig. 5b, c, p <0,05). Der blev dog ikke fundet signifikante forskelle i disse metabolitter mellem BN og HC.
KEGG-signalvejsberigelsesanalyse af signifikant forskellige metabolitter i LA-gruppen sammenlignet med BN- og HC-grupperne. En tosidet Globaltest blev anvendt, og p-værdier blev justeret ved hjælp af Holm-Bonferroni-metoden (justeret p ≤ 0,001 og effektstørrelse > 0,01). b–d Violinplot, der viser hypoxanthin-, xanthin-, laktat-, pyruvat- og tryptofanniveauer i serum-HC, BN og LA bestemt ved LC-MS/MS (n = 70 pr. gruppe). Hvide og sorte stiplede linjer angiver henholdsvis medianen og kvartilen. e Violinplot, der viser normaliseret Log2TPM (transkripter pr. million) mRNA-ekspression af SLC7A5 og QPRT i lungeadenokarcinom (n = 513) sammenlignet med normalt lungevæv (n = 59) i LUAD-TCGA-datasættet. Den hvide boks repræsenterer interkvartilintervallet, den vandrette sorte linje i midten repræsenterer medianen, og den lodrette sorte linje, der strækker sig fra boksen, repræsenterer 95% konfidensintervallet (CI). f Pearson korrelationsplot af SLC7A5- og GAPDH-ekspression i lungeadenokarcinom (n = 513) og normalt lungevæv (n = 59) i TCGA-datasættet. Det grå område repræsenterer 95% CI. r, Pearson korrelationskoefficient. g Normaliserede cellulære tryptofanniveauer i A549-celler transficeret med uspecifik shRNA-kontrol (NC) og shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bestemt ved LC-MS/MS. Statistisk analyse af fem biologisk uafhængige prøver i hver gruppe præsenteres. h Cellulære niveauer af NADt (total NAD, inklusive NAD+ og NADH) i A549-celler (NC) og SLC7A5 knockdown A549-celler (Sh1, Sh2). Statistisk analyse af tre biologisk uafhængige prøver i hver gruppe præsenteres. i Glykolytisk aktivitet af A549-celler før og efter SLC7A5-nedlukning blev målt ved ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR) (n = 4 biologisk uafhængige prøver pr. gruppe). 2-DG,2-deoxy-D-glukose. Tosidet Student's t-test blev anvendt i (b-h). I (g-i) repræsenterer fejlsøjlerne middelværdien ± SD, hvert eksperiment blev udført tre gange uafhængigt, og resultaterne var ensartede. Kildedata leveres i form af kildedatafiler.
I betragtning af den signifikante indvirkning af ændret tryptofanmetabolisme i LA-gruppen, vurderede vi også serumtryptofanniveauer i HC-, BN- og LA-grupperne ved hjælp af QQQ. Vi fandt, at serumtryptofan var reduceret i LA sammenlignet med HC eller BN (p < 0,001, figur 5d), hvilket er i overensstemmelse med tidligere fund om, at cirkulerende tryptofanniveauer er lavere hos patienter med lungekræft end hos raske kontrolpersoner fra kontrolgruppen33,34,35. Et andet studie, der brugte PET/CT-traceren 11C-methyl-L-tryptofan, viste, at tryptofansignalretentionstiden i lungekræftvæv var signifikant forøget sammenlignet med godartede læsioner eller normalt væv36. Vi antager, at faldet i tryptofan i LA-serum kan afspejle aktiv tryptofanoptagelse af lungekræftceller.
Det er også kendt, at slutproduktet af kynurenin-signalvejen i tryptofankatabolisme er NAD+37,38, som er et vigtigt substrat for reaktionen af glyceraldehyd-3-phosphat med 1,3-bisphosphoglycerat i glykolyse39. Mens tidligere undersøgelser har fokuseret på tryptofankatabolismens rolle i immunregulering, søgte vi at belyse samspillet mellem tryptofandysregulering og glykolytiske signalveje observeret i den aktuelle undersøgelse. Transportørfamilie 7, medlem 5 (SLC7A5), er kendt for at være en tryptofantransportør43,44,45. Quinolinsyrephosphoribosyltransferase (QPRT) er et enzym placeret nedstrøms for kynurenin-signalvejen, der omdanner quinolinsyre til NAMN46. Inspektion af LUAD TCGA-datasættet viste, at både SLC7A5 og QPRT var signifikant opreguleret i tumorvæv sammenlignet med normalt væv (fig. 5e). Denne stigning blev observeret i stadie I og II samt stadie III og IV af lungeadenocarcinom (Supplerende Figur 11), hvilket indikerer tidlige forstyrrelser i tryptofanmetabolismen forbundet med tumorigenese.
Derudover viste LUAD-TCGA-datasættet en positiv korrelation mellem SLC7A5 og GAPDH mRNA-ekspression i kræftpatientprøver (r = 0,45, p = 1,55E-26, figur 5f). Derimod blev der ikke fundet nogen signifikant korrelation mellem sådanne gensignaturer i normalt lungevæv (r = 0,25, p = 0,06, figur 5f). Nedregulering af SLC7A5 (supplerende figur 12) i A549-celler reducerede signifikant cellulære tryptofan- og NAD(H)-niveauer (figur 5g,h), hvilket resulterede i en dæmpet glykolytisk aktivitet målt ved ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR) (figur 1). 5i). Baseret på metaboliske ændringer i serum og in vitro-detektion antager vi således, at tryptofanmetabolisme kan producere NAD+ gennem kynurenin-signalvejen og spille en vigtig rolle i at fremme glykolyse i lungekræft.
Studier har vist, at et stort antal ubestemte lungeknuder detekteret ved LDCT kan føre til behov for yderligere testning såsom PET-CT, lungebiopsi og overbehandling på grund af en falsk positiv diagnose af malignitet.31 Som vist i figur 6 identificerede vores undersøgelse et panel af serummetabolitter med potentiel diagnostisk værdi, der kan forbedre risikostratificering og efterfølgende behandling af lungeknuder detekteret ved CT.
Lungeknuder evalueres ved hjælp af lavdosis computertomografi (LDCT) med billeddiagnostiske tegn, der tyder på benigne eller ondartede årsager. Det usikre udfald af knuder kan føre til hyppige opfølgningsbesøg, unødvendige interventioner og overbehandling. Inkludering af serummetaboliske klassifikatorer med diagnostisk værdi kan forbedre risikovurdering og efterfølgende behandling af lungeknuder. PET positronemissionstomografi.
Data fra det amerikanske NLST-studie og det europæiske NELSON-studie tyder på, at screening af højrisikogrupper med lavdosis computertomografi (LDCT) kan reducere dødeligheden af lungekræft1,3. Risikovurdering og efterfølgende klinisk behandling af et stort antal tilfældige lungeknuder opdaget ved LDCT er dog fortsat den mest udfordrende. Hovedmålet er at optimere den korrekte klassificering af eksisterende LDCT-baserede protokoller ved at inkorporere pålidelige biomarkører.
Visse molekylære biomarkører, såsom blodmetabolitter, er blevet identificeret ved at sammenligne lungekræft med raske kontrolpersoner15,17. I den aktuelle undersøgelse fokuserede vi på anvendelsen af serummetabolomikanalyse til at skelne mellem godartede og maligne lungeknuder, der tilfældigt blev detekteret ved LDCT. Vi sammenlignede det globale serummetabolom hos raske kontrolpersoner (HC), godartede lungeknuder (BN) og stadium I lungeadenocarcinom (LA)-prøver ved hjælp af UPLC-HRMS-analyse. Vi fandt, at HC og BN havde lignende metaboliske profiler, hvorimod LA viste signifikante ændringer sammenlignet med HC og BN. Vi identificerede to sæt serummetabolitter, der adskiller LA fra HC og BN.
Den nuværende LDCT-baserede identifikationsordning for godartede og ondartede knuder er primært baseret på størrelsen, densiteten, morfologien og vækstraten af knuder over tid30. Tidligere undersøgelser har vist, at størrelsen af knuder er tæt forbundet med sandsynligheden for lungekræft. Selv hos højrisikopatienter er risikoen for malignitet i lymfeknuder <6 mm <1%. Risikoen for malignitet for knuder, der måler 6 til 20 mm, varierer fra 8% til 64%30. Derfor anbefaler Fleischner Society en grænseværdi på 6 mm til rutinemæssig CT-opfølgning.29 Risikovurdering og behandling af ubestemte lungeknuder (IPN) større end 6 mm er dog ikke blevet udført tilstrækkeligt31. Den nuværende behandling af medfødt hjertesygdom er normalt baseret på vågen afventning med hyppig CT-overvågning.
Baseret på det validerede metabolom demonstrerede vi for første gang overlapningen af metabolomiske signaturer mellem raske individer og godartede knuder <6 mm. Den biologiske lighed er i overensstemmelse med tidligere CT-fund om, at risikoen for malignitet for knuder <6 mm er lige så lav som for forsøgspersoner uden knuder.30 Det skal bemærkes, at vores resultater også viser, at godartede knuder <6 mm og ≥6 mm har høj lighed i metabolomiske profiler, hvilket tyder på, at den funktionelle definition af godartet ætiologi er konsistent uanset knudens størrelse. Moderne diagnostiske serummetabolitpaneler kan således give et enkelt assay som en udelukkelsestest, når knuder initialt detekteres på CT, og potentielt reducere seriel overvågning. Samtidig skelnede det samme panel af metaboliske biomarkører mellem maligne knuder ≥6 mm i størrelse fra godartede knuder og gav nøjagtige forudsigelser for IPN'er af lignende størrelse og tvetydige morfologiske træk på CT-billeder. Denne serummetabolismeklassifikator klarede sig godt til at forudsige maligniteten af knuder ≥6 mm med en AUC på 0,927. Samlet set indikerer vores resultater, at unikke serummetabolomiske signaturer specifikt kan afspejle tidlige tumorinducerede metaboliske ændringer og har potentiel værdi som risikoprædiktorer, uafhængigt af knudens størrelse.
Det er værd at bemærke, at lungeadenokarcinom (LUAD) og pladecellekarcinom (LUSC) er de vigtigste typer af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Da LUSC er stærkt forbundet med tobaksbrug47, og LUAD er den mest almindelige histologi af tilfældige lungeknuder, der opdages ved CT-screening48, blev vores klassificeringsmodel specifikt bygget til stadium I-adenokarcinomprøver. Wang og kolleger fokuserede også på LUAD og identificerede ni lipidsignaturer ved hjælp af lipidomics til at skelne lungekræft i tidligt stadie fra raske individer17. Vi testede den nuværende klassificeringsmodel på 16 tilfælde af stadium I LUSC og 74 godartede knuder og observerede lav LUSC-forudsigelsesnøjagtighed (AUC 0,776), hvilket tyder på, at LUAD og LUSC kan have deres egne metabolomiske signaturer. Faktisk har LUAD og LUSC vist sig at adskille sig i ætiologi, biologisk oprindelse og genetiske afvigelser49. Derfor bør andre typer histologi inkluderes i træningsmodeller til populationsbaseret detektion af lungekræft i screeningsprogrammer.
Her identificerede vi de seks hyppigst ændrede metabolitter i lungeadenokarcinom sammenlignet med raske kontrolpersoner og godartede knuder. Xanthin og hypoxanthin er almindelige metabolitter i purinmetabolismen. I overensstemmelse med vores resultater var mellemprodukter forbundet med purinmetabolisme signifikant forhøjede i serum eller væv hos patienter med lungeadenokarcinom sammenlignet med raske kontrolpersoner eller patienter i det præinvasive stadie15,50. Forhøjede serumniveauer af xanthin og hypoxanthin kan afspejle den anabolisme, der kræves af hurtigt prolifererende kræftceller. Dysregulering af glukosemetabolismen er et velkendt kendetegn for kræftmetabolisme51. Her observerede vi en signifikant stigning i pyruvat og laktat i LA-gruppen sammenlignet med HC- og BN-gruppen, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter om glykolytiske abnormiteter i serummetabolomprofilerne hos patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og raske kontrolpersoner. Resultaterne er konsistente52,53.
Det er vigtigt at bemærke, at vi observerede en omvendt korrelation mellem pyruvat- og tryptofanmetabolisme i serum fra lungeadenokarcinomer. Serumtryptofanniveauer var reduceret i LA-gruppen sammenlignet med HC- eller BN-gruppen. Interessant nok fandt et tidligere storstilet studie med en prospektiv kohorte, at lave niveauer af cirkulerende tryptofan var forbundet med en øget risiko for lungekræft 54. Tryptofan er en essentiel aminosyre, som vi udelukkende får fra mad. Vi konkluderer, at serumtryptofanudtømning ved lungeadenokarcinom kan afspejle en hurtig udtømning af denne metabolit. Det er velkendt, at slutproduktet af tryptofankatabolisme via kynurenin-signalvejen er kilden til de novo NAD+ syntese. Fordi NAD+ primært produceres gennem bjærgningssignalvejen, er vigtigheden af NAD+ i tryptofanmetabolisme i sundhed og sygdom stadig uafklaret 46. Vores analyse af TCGA-databasen viste, at ekspressionen af tryptofantransportøren 7A5 (SLC7A5) var signifikant forhøjet i lungeadenocarcinom sammenlignet med normale kontrolpersoner og var positivt korreleret med ekspressionen af det glykolytiske enzym GAPDH. Tidligere undersøgelser har primært fokuseret på tryptofankatabolismens rolle i at undertrykke antitumorimmunresponset40,41,42. Her demonstrerer vi, at hæmning af tryptofanoptagelse ved nedbrydning af SLC7A5 i lungekræftceller resulterer i et efterfølgende fald i cellulære NAD-niveauer og en samtidig dæmpning af glykolytisk aktivitet. Sammenfattende giver vores undersøgelse et biologisk grundlag for ændringer i serummetabolisme forbundet med malign transformation af lungeadenocarcinom.
EGFR-mutationer er de mest almindelige drivermutationer hos patienter med NSCLC. I vores undersøgelse fandt vi, at patienter med EGFR-mutation (n = 41) havde generelle metaboliske profiler svarende til patienter med vildtype EGFR (n = 31), selvom vi fandt nedsatte serumniveauer hos nogle EGFR-mutantpatienter hos acylcarnitinpatienter. Acylcarnitiners etablerede funktion er at transportere acylgrupper fra cytoplasmaet ind i mitokondriale matrixer, hvilket fører til oxidation af fedtsyrer for at producere energi 55. I overensstemmelse med vores resultater identificerede et nyligt studie også lignende metabolomprofiler mellem EGFR-mutant- og EGFR-vildtypetumorer ved at analysere det globale metabolom af 102 lungeadenocarcinomvævsprøver 50. Interessant nok blev acylcarnitinindhold også fundet i EGFR-mutantgruppen. Derfor kan det være nødvendigt at undersøge, om ændringer i acylcarnitinniveauer afspejler EGFR-inducerede metaboliske ændringer og de underliggende molekylære veje.
Afslutningsvis etablerer vores undersøgelse en serummetabolisk klassifikator til differentialdiagnose af lungeknuder og foreslår en arbejdsgang, der kan optimere risikovurdering og lette klinisk behandling baseret på CT-scanning.
Dette studie blev godkendt af den etiske komité på Sun Yat-sen University Cancer Hospital, det første tilknyttede hospital på Sun Yat-sen University og den etiske komité på Zhengzhou University Cancer Hospital. I grupperne for opdagelse og intern validering blev 174 sera fra raske individer og 244 sera fra godartede knuder indsamlet fra individer, der gennemgik årlige lægeundersøgelser på afdelingen for kræftkontrol og -forebyggelse, Sun Yat-sen University Cancer Center, og 166 godartede knuder i serum. Stadie I lungeadenokarcinomer blev indsamlet fra Sun Yat-sen University Cancer Center. I den eksterne valideringskohorte var der 48 tilfælde af godartede knuder, 39 tilfælde af stadium I lungeadenokarcinom fra det første tilknyttede hospital på Sun Yat-sen University og 24 tilfælde af stadium I lungeadenokarcinom fra Zhengzhou Cancer Hospital. Sun Yat-sen University Cancer Center indsamlede også 16 tilfælde af stadium I pladecellelungekræft for at teste den etablerede metaboliske klassifikators diagnostiske evne (patientkarakteristika er vist i supplerende tabel 5). Prøver fra opdagelseskohorten og den interne valideringskohorte blev indsamlet mellem januar 2018 og maj 2020. Prøver til den eksterne valideringskohorte blev indsamlet mellem august 2021 og oktober 2022. For at minimere kønsbias blev omtrent lige mange mandlige og kvindelige tilfælde tildelt hver kohorte. Opdagelsesteam og internt evalueringsteam. Deltagernes køn blev bestemt baseret på selvrapportering. Informeret samtykke blev indhentet fra alle deltagere, og der blev ikke ydet nogen kompensation. Forsøgspersoner med benigne knuder var dem med en stabil CT-scanningsscore efter 2 til 5 år på analysetidspunktet, bortset fra 1 tilfælde fra den eksterne valideringsprøve, som blev indsamlet præoperativt og diagnosticeret ved histopatologi. Med undtagelse af kronisk bronkitis. Tilfælde af lungeadenocarcinom blev indsamlet før lungeresektion og bekræftet ved patologisk diagnose. Fastende blodprøver blev indsamlet i serumseparationsrør uden antikoagulantia. Blodprøverne blev koaguleret i 1 time ved stuetemperatur og derefter centrifugeret ved 2851 × g i 10 minutter ved 4 °C for at opsamle serumsupernatant. Serumalikvoter blev frosset ved -80 °C indtil metabolitekstraktion. Afdelingen for Kræftforebyggelse og Medicinsk Undersøgelse ved Sun Yat-sen Universitets Kræftcenter indsamlede en pulje af serum fra 100 raske donorer, herunder et lige antal mænd og kvinder i alderen 40 til 55 år. Lige store mængder af hver donorprøve blev blandet, den resulterende pulje blev alikvoteret og opbevaret ved -80 °C. Serumblandingen blev brugt som referencemateriale til kvalitetskontrol og datastandardisering.
Referenceserum og testprøver blev optøet, og metabolitter blev ekstraheret ved hjælp af en kombineret ekstraktionsmetode (MTBE/methanol/vand) 56. Kort fortalt blev 50 μl serum blandet med 225 μl iskold methanol og 750 μl iskold methyl-tert-butylether (MTBE). Blandingen omrøres, og blandingen inkuberes på is i 1 time. Prøverne blev derefter blandet og vortexblandet med 188 μl MS-kvalitetsvand indeholdende interne standarder (13C-laktat, 13C3-pyruvat, 13C-methionin og 13C6-isoleucin, købt fra Cambridge Isotope Laboratories). Blandingen blev derefter centrifugeret ved 15.000 × g i 10 minutter ved 4 °C, og den nedre fase blev overført til to rør (125 μl hver) til LC-MS-analyse i positiv og negativ tilstand. Endelig blev prøven inddampet til tørhed i en højhastighedsvakuumkoncentrator.
De tørrede metabolitter blev rekonstitueret i 120 μl 80% acetonitril, vortexet i 5 minutter og centrifugeret ved 15.000 × g i 10 minutter ved 4°C. Supernatanter blev overført til ravfarvede glasflasker med mikroindsatser til metabolomiske undersøgelser. Umålrettet metabolomisk analyse på en ultra-performance liquid chromatography-high-resolution massespectrometri (UPLC-HRMS) platform. Metabolitterne blev separeret ved hjælp af et Dionex Ultimate 3000 UPLC-system og en ACQUITY BEH Amide-søjle (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). I positiv iontilstand var de mobile faser 95% (A) og 50% acetonitril (B), hver indeholdende 10 mmol/L ammoniumacetat og 0,1% myresyre. I negativ tilstand indeholdt de mobile faser A og B henholdsvis 95 % og 50 % acetonitril, begge faser indeholdt 10 mmol/L ammoniumacetat, pH = 9. Gradientprogrammet var som følger: 0-0,5 min, 2 % B; 0,5-12 min, 2-50 % B; 12-14 min, 50-98 % B; 14-16 min, 98 % B; 16-16,1 min, 98-2 % B; 16,1-20 min, 2 % B. Kolonnen blev opbevaret ved 40 °C, og prøven ved 10 °C i autosampleren. Flowhastigheden var 0,3 ml/min, injektionsvolumenet var 3 μl. Et Q-Exactive Orbitrap massespektrometer (Thermo Fisher Scientific) med en elektrosprayioniseringskilde (ESI) blev drevet i fuld scanningstilstand og koblet til ddMS2-overvågningstilstanden for at indsamle store datamængder. MS-parametrene blev indstillet som følger: sprayspænding +3,8 kV/- 3,2 kV, kapillærtemperatur 320 °C, beskyttelsesgas 40 arb, hjælpegas 10 arb, probevarmertemperatur 350 °C, scanningsområde 70-1050 m/t, opløsning 70.000. Data blev indsamlet ved hjælp af Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
For at vurdere datakvaliteten blev der genereret samlede kvalitetskontrolprøver (QC) ved at fjerne 10 μL aliquoter af supernatanten fra hver prøve. Seks injektioner af kvalitetskontrolprøver blev analyseret i begyndelsen af den analytiske sekvens for at vurdere stabiliteten af UPLC-MS-systemet. Kvalitetskontrolprøver introduceres derefter periodisk i batchen. Alle 11 batcher af serumprøver i dette studie blev analyseret ved hjælp af LC-MS. Alikvoter af en serumpoolblanding fra 100 raske donorer blev brugt som referencemateriale i respektive batcher for at overvåge ekstraktionsprocessen og justere for batch-til-batch-effekter. Umålrettet metabolomisk analyse af opdagelseskohorten, den interne valideringskohorte og den eksterne valideringskohorte blev udført på Metabolomics Center på Sun Yat-sen University. Det eksterne laboratorium på Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center analyserede også 40 prøver fra den eksterne kohorte for at teste klassificeringsmodellens ydeevne.
Efter ekstraktion og rekonstituering blev absolut kvantificering af serummetabolitter målt ved hjælp af ultra-højtydende væskekromatografi-tandem massespektrometri (Agilent 6495 triple quadrupole) med en elektrosprayioniseringskilde (ESI) i multiple reaction monitoring (MRM) mode. En ACQUITY BEH Amide-søjle (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) blev anvendt til at separere metabolitterne. Den mobile fase bestod af 90% (A) og 5% acetonitril (B) med 10 mmol/L ammoniumacetat og 0,1% ammoniakopløsning. Gradientprogrammet var som følger: 0-1,5 min, 0% B; 1,5-6,5 min, 0-15% B; 6,5-8 min, 15% B; 8-8,5 min, 15%-0% B; 8,5-11,5 min, 0% B. Kolonnen blev holdt ved 40 °C og prøven ved 10 °C i autosampleren. Strømningshastigheden var 0,3 mL/min, og injektionsvolumenet var 1 μL. MS-parametrene blev indstillet som følger: kapillærspænding ±3,5 kV, forstøvertryk 35 psi, sheathgasflow 12 L/min, sheathgastemperatur 350 °C, tørregastemperatur 250 °C og tørregasflow 14 l/min. MRM-omdannelserne af tryptofan, pyruvat, laktat, hypoxanthin og xanthin var henholdsvis 205,0-187,9, 87,0-43,4, 89,0-43,3, 135,0-92,3 og 151,0-107,9. Data blev indsamlet ved hjælp af Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). For serumprøver blev tryptofan, pyruvat, laktat, hypoxanthin og xanthin kvantificeret ved hjælp af kalibreringskurver for standardblandingsopløsninger. For celleprøver blev tryptofanindholdet normaliseret til den interne standard og celleproteinmassen.
Peak-ekstraktion (m/z og retentionstid (RT)) blev udført ved hjælp af Compound Discovery 3.1 og TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). For at eliminere potentielle forskelle mellem batcher blev hver karakteristisk top i testprøven divideret med den karakteristiske top for referencematerialet fra samme batch for at opnå den relative forekomst. De relative standardafvigelser for interne standarder før og efter standardisering er vist i Supplerende Tabel 6. Forskelle mellem de to grupper blev karakteriseret ved falsk opdagelsesrate (FDR < 0,05, Wilcoxon signed rank test) og fold-ændring (> 1,2 eller < 0,83). Rå MS-data for de ekstraherede funktioner og referenceserumkorrigerede MS-data er vist i henholdsvis Supplerende Data 1 og Supplerende Data 2. Peak-annotation blev udført baseret på fire definerede identifikationsniveauer, herunder identificerede metabolitter, putativt annoterede forbindelser, putativt karakteriserede forbindelsesklasser og ukendte forbindelser 22. Baseret på databasesøgninger i Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) blev biologiske forbindelser med MS/MS-matchende validerede standarder eller eksakte match-annoteringer i mzCloud (score > 85) eller Chemspider endeligt udvalgt som mellemprodukter mellem det differentielle metabolom. Peak-annoteringer for hver funktion er inkluderet i Supplerende Data 3. MetaboAnalyst 5.0 blev brugt til univariat analyse af sum-normaliseret metabolitmængde. MetaboAnalyst 5.0 evaluerede også KEGG-signalvejsberigelsesanalyse baseret på signifikant forskellige metabolitter. Principal component analysis (PCA) og partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) blev analyseret ved hjælp af ropls-softwarepakken (v.1.26.4) med staknormalisering og autoskalering. Den optimale metabolitbiomarkørmodel til forudsigelse af knudemalignitet blev genereret ved hjælp af binær logistisk regression med mindst absolut krympning og selektionsoperator (LASSO, R-pakke v.4.1-3). Diskriminantmodellens ydeevne i detektions- og valideringssættene blev karakteriseret ved at estimere AUC baseret på ROC-analyse i henhold til pROC-pakken (v.1.18.0.). Den optimale sandsynlighedsgrænse blev opnået baseret på modellens maksimale Youden-indeks (følsomhed + specificitet – 1). Prøver med værdier mindre eller større end tærsklen vil blive forudsagt som henholdsvis godartede knuder og lungeadenokarcinom.
A549-celler (#CCL-185, American Type Culture Collection) blev dyrket i F-12K-medium indeholdende 10% FBS. Korte hårnåle-RNA (shRNA)-sekvenser rettet mod SLC7A5 og en ikke-målrettet kontrol (NC) blev indsat i den lentivirale vektor pLKO.1-puro. Antisense-sekvenserne for shSLC7A5 er som følger: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antistoffer mod SLC7A5 (#5347) og tubulin (#2148) blev købt fra Cell Signaling Technology. Antistoffer mod SLC7A5 og tubulin blev anvendt i en fortynding på 1:1000 til Western blot-analyse.
Seahorse XF glykolytisk stresstest måler niveauer af ekstracellulær forsuring (ECAR). I analysen blev glukose, oligomycin A og 2-DG administreret sekventielt for at teste cellulær glykolytisk kapacitet målt ved ECAR.
A549-celler transficeret med ikke-målrettet kontrol (NC) og shSLC7A5 (Sh1, Sh2) blev udpladet natten over i skåle med en diameter på 10 cm. Cellemetabolitter blev ekstraheret med 1 ml iskold 80% vandig methanol. Celler i methanolopløsningen blev skrabet af, opsamlet i et nyt rør og centrifugeret ved 15.000 × g i 15 minutter ved 4°C. Opsaml 800 µl supernatant og tør ved hjælp af en højhastighedsvakuumkoncentrator. De tørrede metabolitpellets blev derefter analyseret for tryptofanniveauer ved hjælp af LC-MS/MS som beskrevet ovenfor. Cellulære NAD(H)-niveauer i A549-celler (NC og shSLC7A5) blev målt ved hjælp af et kvantitativt NAD+/NADH kolorimetrisk kit (#K337, BioVision) i henhold til producentens instruktioner. Proteinniveauer blev målt for hver prøve for at normalisere mængden af metabolitter.
Der blev ikke anvendt statistiske metoder til foreløbigt at bestemme stikprøvestørrelsen. Tidligere metabolomiske studier rettet mod opdagelse af biomarkører15,18 er blevet betragtet som benchmarks for størrelsesbestemmelse, og sammenlignet med disse rapporter var vores stikprøve tilstrækkelig. Ingen prøver blev ekskluderet fra studiekohorten. Serumprøver blev tilfældigt tildelt en opdagelsesgruppe (306 tilfælde, 74,6%) og en intern valideringsgruppe (104 tilfælde, 25,4%) for ikke-målrettede metabolomiske studier. Vi udvalgte også tilfældigt 70 tilfælde fra hver gruppe fra opdagelsessættet for målrettede metabolomiske studier. Forskerne var blindede for gruppetildeling under LC-MS dataindsamling og -analyse. Statistiske analyser af metabolomiske data og celleforsøg er beskrevet i de respektive afsnit om resultater, figurforklaringer og metoder. Kvantificering af cellulær tryptofan, NADT og glykolytisk aktivitet blev udført tre gange uafhængigt med identiske resultater.
For mere information om studiedesignet, se Natural Portfolio Report Abstract, der er knyttet til denne artikel.
De rå MS-data for de ekstraherede funktioner og de normaliserede MS-data for referenceserummet er vist i henholdsvis Supplerende Data 1 og Supplerende Data 2. Peak-annotationer for differentielle funktioner er præsenteret i Supplerende Data 3. LUAD TCGA-datasættet kan downloades fra https://portal.gdc.cancer.gov/. Inputdataene til plotning af grafen findes i kildedataene. Kildedata er angivet for denne artikel.
National Lung Screening Study Group m.fl. Reduktion af lungekræftdødelighed med lavdosis computertomografi. Northern England. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR og Prophet, PC. Screening for lungekræft ved hjælp af lavdosis-spiral-CT: resultater fra National Lung Screening Study (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Reduktion af lungekræftdødelighed med volumetrisk CT-screening i et randomiseret forsøg. Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Opslagstidspunkt: 18. september 2023